Визначення активності каталази
(за О.М. Бахом та А.І. Опаріном)
Оксидоредуктази – клас ферментів, що каталізують окисно-відновні реакції. Окислення мономерів, що утворюються в процесі катаболізму полімерів, є складним багатоступеневим процесом.
Окислення речовин у клітинах протікає, в основному, шляхом відщеплення водню (дегідруванням) або відщепленням електронів або шляхом приєднання кисню до молекули сполуки, що окислюється.
Акцепторами водню у дегідрогеназу є НАД + , НАДФ, ФАД і ФМН, у деяких флавінових - кисень (їх називають оксидазами), у гемовмісних (пероксидаз і каталази) - Н2О2 (пероксид водню).
Акцепторами та переносниками електронів є цитохроми, що містять гем (гемопротеїни).
Каталаза (КФ 1.11.1.6) відноситься до гемопротеїнів, каталізує процес руйнування отруйного для клітин пероксиду водню на воду та кисень: 2 H2O2 = 2 H2O + O2.
Для живої клітини пероксид водню є сильною отрутою, тому всі ферменти, що утворюють і знешкоджують Н2О2, знаходяться в пероксисомах – органелах покритих мембраною. Головними споживачами Н2О2 є пероксидази (КФ 1.11.1.7.), які окислюють феноли, аміни, деякі гетероциклічні сполуки та ін. Молекули пероксиду водню, незатребувані пероксидазами, знешкоджуються каталазою.
Метод визначення активності каталази ґрунтується на визначенні кількості пероксиду водню, розщепленого в процесі інкубації з ферментом. Кількість H2O2 у реакційній суміші визначають титруванням у кислому середовищі розчином з концентрацією перманганату калію 0,02 моль/л:
На підставі наведеного рівняння реакції можна розрахувати, що 1 млрозчину з концентрацією перманганату калію 0,02моль/л відповідає 1,7мг (50мкмоль) пероксиду водню.
ХІД РОБОТИ. 2-3 г сирої картоплі (або іншого свіжого рослинного матеріалу) ретельно розтирають у ступці з кварцовим піском або склом. Для зменшення кислої реакції додають на кінчику скальпеля CaCO3 до припинення виділення бульбашок СО2. У процесі розтирання до ступки додають невеликими порціями 40-50 мл води. Розтерту масу кількісно переносять у мірну колбу місткістю 100 мл, доводять водою до мітки та перемішують. Суміш залишають стояти 10-15 хв після перемішування фільтрують.
Беруть дві конічні колбочки місткістю 150-200 мл і вносять у них 20 мл отриманого фільтрату. Вміст однієї колби кип'ятять протягом 1 хв. і охолоджують до кімнатної температури (контроль). Інша досвідчена колба містить активний фермент. До вмісту дослідної та контрольної колб доливають по 20 мл води та по 3 мл розчину з масовою часткою H2O2 1 %. Вміст ретельно перемішують та залишають при кімнатній температурі на 30 хв. Після закінчення інкубації обидві колби додають по 5 мл розчину з масовою часткою сірчаної кислоти 10 %, перемішують і надлишок H2O2 в кожній колбі відтитрують розчином з концентрацією перманганату калію 0,02 моль/л до утворення рожевого фарбування, що не зникає протягом 1 хв.
Активність каталази виражають у мкмоль пероксиду водню, що розщепився під дією ферменту з розрахунку на 1 г досліджуваного матеріалу (або на 1 мг витяжки з нього) за 1 хв. Обчислення ведуть за такою формулою:
,
деХ- активність каталази, Е/г;
(а-b)- різниця між об'ємами розчину з концентрацією перманганату калію 0,02 моль/л, що пішов на титрування контрольної(а)та дослідної(b)проб,мл;
Т– титр застосованого для титрування розчину перманганату калію;
50 - коефіцієнт перерахунку на мкмоль H2O2;
100 - загальний обсяг приготовленого екстракту;
m - маса взятого для аналізу матеріалу, г;
20 - обсяг фільтрату, взятого для аналізу, мл;
30 - час інкубації, хв.
Принцип визначення, порядок аналізу та результат аналізу записують.
Активність каталази можна визначити і за обсягом кисню, що виділився після додавання до об'єкту досліджуваного H2O2.
Цей принцип використовують для визначення активності каталази в молоці, що виражається каталазним числом, що являє собою обсяг кисню (мл), що виділився за 2 години при 25 °З доданих до 15 мл молока 5 мг розчину з масовою часткою H2O2 1 %. Молоко, отримане здорових тварин, виділяє 0,7-2,5 мл кисню, тобто. каталазне число натурального молока становить трохи більше 2,5. Молоко, отримане від хворих тварин (мастит та ін), та молозиво мають підвищені каталажні числа, що досягають до 15.
РЕАКТИВИ. Вода дистильована; кальцій вуглекислий (порошок); розчин із концентрацією перманганату калію 0,02 моль/л; розчини з масовими частками: пероксиду водню 1 % (10 мл розчину з масовою часткою H2O2 30 % розбавити водою до 300 мл), сірчаної кислоти 10 %.
1. Основні шляхи окислення субстратів у клітині.
2. Характеристика будови та дії НАД+- та НАДФ-залежних дегідрогеназів.
3. Характеристика будови та дії ФАД-залежних дегідрогеназів.
4. Які ферменти називають оксидазами? Їхні кофактори.
5. Характеристика будови та дії пероксидаз та каталаз.
6. Характеристика будови та дії цитохромів.
7. Хімізм, освіта та шляхи знешкодження пероксиду водню вклітинах.