Визначення азитроміцину в плазмі крові методом ВЕРХ з мас-спектрометричним детектуванням.
Розроблено метод кількісного визначення азитроміцину для ВЕРХ з мас-спектрометричним детектуванням. Межа виявлення препарату становить 0,5 нг/мл. Метод був застосований для вивчення фармакокінетики та біоеквівалентності препарату Азітроміцин (капсули по 250 мг) у порівнянні з препаратом Сумамед® (аналогічна лікарська форма виробництва компанії Плива, Хорватія). Фармакокінетичне дослідження проводилося відкритим перехресним рандомізованим методом. До дослідження було включено 18 добровольців. Були розраховані фармакокінетичні параметри, необхідні для оцінки біоеквівалентності препарату, що вивчається. Статистичний аналіз параметрів фармакокінетики показав біоеквівалентність препаратів Азітроміцин та Сумамед.
Азітроміцин (9-деоксо-9а-аза-9а-метил-9а-гомоеритроміцин (А) у вигляді дигідрату) – антибіотик широкого спектра дії. Наявність у його хімічній структурі атома азоту дозволяє віднести цей препарат до нової підгрупи макролідних антибіотиків – азалідів. Порівняно з іншими макролідами має найбільш виражений бактерицидний ефект, здатність проникати в тканини, рідини та клітини організму, максимальну тривалість періоду напіввиведення.
Азітроміцин стійкий у кислому середовищі, завдяки чому швидко всмоктується у шлунково-кишковому тракті (час досягнення максимальної концентрації 2-3 години). Високий рівень всмоктування забезпечується ліпофільністю молекули азитроміцину. Після прийому внутрішньо 500 мг препарату біодоступність становить 37%. Максимальна концентрація у сироватці після прийому цієї дози 0,4 мг/л, однак у тканинах і клітинах концентрація у 10-50 разів вища, а в осередках інфекції на 24-34% більше, ніж у здоровихтканинах і корелює зі ступенем запального набряку.
Елімінація азитроміцину з сироватки проходить у два етапи: Т½ становить 14-20 год між 8 і 24 год після прийому препарату та 41 год в інтервалі від 24 до 72 год, що дозволяє приймати препарат 1 раз на добу [1].
У літературі є кілька публікацій, присвячених кількісному визначенню азитроміцину у біологічних рідинах методом ВЕРХ. Так, у роботах [2, 3, 4] аналіз проводили методом ВЕРХ з електрохімічним детектором та чутливістю виявлення препарату у плазмі крові 10 нг/мл. У доповіді [5] описані умови визначення азитроміцину методом ВЕРХ з детектором флюоресценції. Чутливість у разі склала 98,8 нг/мл. Авторами роботи [6] наведено результати порівняння методів ВЕРХ із мас-спекрометричним (хімічна іонізація при атмосферному тиску) та електрохімічним детектуванням, використаних для кількісного виявлення препарату в плазмі крові. У цьому дослідженні задовільна точність і відтворюваність результатів аналізу спостерігалася в діапазоні концентрацій 10 – 250 нг/мл та обидва методи показали хорошу кореляцію між собою.
Матеріали та методи. Аналіз проводили на рідинному хроматографі «Agilent 1100» (США), оснащеному вакуумним дегазатором, градієнтним насосом, автосамплером і термостатом колонок, а також мас-спектрометричним детектором «Agilent 1100VL» (США) при атмосферному тиску в електроспреї (API-ES). При приготуванні проби використовувалися вакуумний концентратор DNA mini (Австрія) та картриджі для твердофазної екстракції AccuBond II ODS-C18, 100 мг виробництва Agilent (США).
У роботі використовували наступні реактиви: ацетонітрил 1-го ґатунку («Кріохром», Санкт-Петербург), мурашина кислота (Merck), ацетатамонію та ацетат натрію (Merck).
Хроматографічне поділ здійснювали на колонці Eсlipse SB-C18, 5 мкм, 4,6 х 150 мм (США) при температурі 70°С. Елюювання проводили в ізократичному режимі. Склад рухомої фази: ацетонітрил – 0,1 M ацетат амонію – 0,002 M ацетат натрію (60:20:20, об/об). Швидкість потоку 0,7 мл/хв.
У мас-спектрі азитроміцину, отриманому при іонізації речовини в електроспреї на приладі з одним квадрупольним аналізатором, спостерігався інтенсивний пік з m/z 749,1, що відповідає протонованому молекулярному іону [М+H]+ і з m/z 771,5 - іону адду. +Nа]+. Параметри роботи детектора підбиралися для досягнення максимального виходу аддукта [М+Nа]+: фрагментор 200, напруга капіляра 4500, температура газу 3500С, швидкість 12,0 л/хв, тиск небулайзера 40 psig.
Для виділення азитроміцину із плазми крові та очищення екстракту використовувався метод твердофазної екстракції. Картридж попередньо послідовно промивали 1 мл ацетонітрилу і 2 мл 10% водного розчину ацетонітрилу. До 1 мл плазми додавали 0,5 мл ацетонітрилу, перемішували на vortex 2 хвилини, центрифугували 5 хвилин при 13 000 об/хв. Супернатант переносили до картриджа. Картридж промивали 1 мл 10% водного розчину ацетонітрилу, потім елюювали азитроміцин 4 мл суміші ацетонітрил – 0,01 М ацетат натрію – мурашина кислота (90: 10: 0,1, об/об). Отриманий елюат упарюють насухо під вакуумом при температурі 60˚С. Пробу розчиняли 200 мкл метанолу і аліквоту 50 мкл переносили в хроматограф. Кількісне визначення проводили методом абсолютного калібрування з використанням програмного забезпечення Chemstation фірми Agilent.
Розроблений метод був застосований для вивчення фармакокінетики та біоеквівалентності препаратуАЗИТРОМІЦИНкапсуливітчизняного виробництва, що містять 250 мг азитроміцину в порівнянні з препаратом Сумамед®, фірма «Плива» (Хорватія). До дослідження було включено 18 добровольців. Фармакокінетичне дослідження проводили відкритим перехресним рандомізованим методом у 2 етапи з інтервалом між прийомами препаратів 14 днів. Зразки крові у кількості 4 мл відбирали з кубітальної вени через 0,5; 1; 1,5; 2; 2,5; 3; 5; 8; 12; 24; 48 та 60 годин після прийому препарату. Аналіз фармакокінетичних даних та оцінка біоеквівалентності досліджуваних препаратів проведено відповідно до методичних рекомендацій щодо проведення якісних клінічних досліджень біоеквівалентності лікарських препаратів [7].
Фармакокінетичні параметри розраховували за допомогою програми ESTRIP модельно-незалежним методом. Розраховано такі параметри: максимальна концентрація Cmax препаратів у крові (максимальне виміряне значення); час досягнення максимальної концентрації Tmax; площа під фармакокінетичною кривою AUCo-t; площа під фармакокінетичною кривою AUCo-¥; період напіввиведення T1/2; середній час утримання препаратів у системному кровотоці MRT; відносна швидкість всмоктування Cmax/AUCo-t. Для оцінки досліджуваного препарату розраховували f¢ - відносну біодоступність досліджуваної лікарської форми азитроміцину по відношенню до порівнюваної, що визначається ставленням AUCo-t,T/AUC0-t,R та f¢¢ - відносний ступінь всмоктування азитроміцину, що визначається відношенням Cmax,T/C R.
Отримані експериментальні дані піддавалися статистичній обробці за допомогою програми Statistica v 5.0 і EXCEL'97 для персонального комп'ютера. Розраховувалися такі статистичні параметри: середнє арифметичне значення, середнє геометричне значення,стандартне відхилення середнього результату, межі довірчого інтервалу проведено парне порівняння фармакокінетичних параметрів. Оцінка біоеквівалентності проводилася стосовно параметрів AUCo-t, Cmax і Cmax/AUCo-t (натуральні та ln-перетворені дані).
Результати та обговорення. Хроматографічні характеристики наведеної методики кількісного визначення азитроміцину в плазмі крові наведені в табл. 1.
Таблиця 1.Хроматографічні характеристики методу аналізу