Визначення рН культуральної рідини - стор
Визначення рН культуральної рідини
Визначення рН проводять за допомогою іономіру.
Визначення титрованої кислотності культуральної рідини
Визначення проводять як і, як і першому занятті. Вміст лимонної кислоти (X) обчислюють за такою формулою:
(A 2 - A 1 ) P 100
Розрахунок кількості синтезованої лимонної кислоти
Кількість лимонної кислоти (С), синтезованої грибом, культуральної рідини розраховують за формулою:
Визначення вмісту сухих речовин у культуральній рідині
Визначення проводять за допомогою рефрактометра. Кількість спожитих у процесі культивування сухих речовин (В) дорівнює:
В = В 1 - (В 2 - С), (3.3)
Вихід лимонної кислоти (W) у відсотках від споживаних сухих речовин (B) розраховують за формулою:
де W – вихід лимонної кислоти, %; В - кількість споживаних у процесі культивування сухих речовин %; С – кількість лимонної кислоти, р.
Визначення маси сухого міцелію гриба та його продукуючої здатності.
Фільтри з біомасою гриба поміщають у сушильну шафу при температурі 130С на 40 хвилин, сушать до постійної маси, охолоджують в ексікаторі та зважують на аналітичних вагах. Масу сухого міцелію (Б) розраховують за такою формулою:
Б = М м - М ф , (3.5)
де Б - маса сухого міцелію, г; М ф - маса порожнього фільтра, г; М м - маса фільтра з висушеним міцелієм, р.
Продукувальна здатність міцелію (П) - це кількість лимонної кислоти, що синтезується за циклвирощування 1 г біомаси продуцента. Обчислюють за формулою:
де П - продукує здатність міцелію, г/г; С – кількість лимонної кислоти, г; Б – маса сухого міцелію, г.
Результати досліджень вносять до таблиці 3.2.
На підставі отриманих результатів роблять висновок про здатність гриба Aspergillus niger продукувати лимонну кислоту та вибирають оптимальний склад середовища для отримання лимонної кислоти.
Контрольні питання
1. Які мікроорганізми є продуцентами лимонної кислоти?
2. У яких умовах здійснюється надсинтез лимонної кислоти?
3. Якими способами одержують лимонну кислоту?
4. Як здійснюють поверхневе культивування?
5. У чому суть потенціометричного методу титрування?
Воробйова Л.І. Промислова мікробіологія: Навч. Посібник. - М: Вид-во МДУ, 1989.294 с.
Промислова мікробіологія / Под ред. Н.С. Єгорова.- М.: Вищ.шк., 1989.-688 с.
ЛАБОРАТОРНА РОБОТА № 4
Тема: Одержання білкових препаратів шляхом культивування гриба Penicillium roqueforti на рідкому живильному середовищі.
Мета роботи: Ознайомитись з особливостями отримання мікробної біомаси на різних субстратах. Вивчити здатність цвілевих грибів до продукування білка на молочній сироватці.
Посуд, матеріали, обладнання, реактиви: колби об'ємом 250 мл із ватними пробками – 6; скляні палички – 5; піпетки градуйовані на 10 мл - 6, на 1мл - 6; циліндри мірні на 100 мл – 6; вирви діапметром 10-15 см - 6; скляні стаканчики на 50 мл – 6; мірні колби на 50 мл -6; фільтри паперові складчасті – 6; фільтрувальний папір; щільні фільтри – 6; коби конічні на 100 мл – 6; мікробюретка – 1; бюретка для титрування на 25 мл – 1; стерильні піпетки на 1 мл – 2;спиртівка, бактеріологічна петля, олівець зі скла. Ваги електронні; рефрактометр; іономір; фотоелектроколориметр; термостат. Реактиви: молочна сироватка, 0,1 н розчин NaOH, фенолфталеїн, тимолфталеїн, 1 н розчин NaOH, суспезія фосфату міді, йодит калію, крохмаль, 0,01 р-р тіосульфату натрію, оцтова кислота (конц.), 2, розчин сульфосаліцилової кислоти, прбірки з чистою культурою Penicillium roqueforti - 2, пробірки зі стерильною водою - 2.
Короткі теоретичні положення
Нині найбільш дефіцитним компонентом їжі є білок, особливо білок високої поживної цінності. Основним шляхом зниження та ліквідації цього дефіциту є виробництво біомаси за допомогою мікробного синтезу. Мікробіологічне виробництво білка не потребує посівних площ, не залежить від кліматичних та погодних умов, піддається точному плануванню та високому рівню автоматизації, дозволяє отримувати продукцію стандартної якості.
Для цілей мікробного синтезу білка можуть бути використані ті мікроорганізми, які мають здатність під впливом складу живильного середовища та фізико-хімічних умов культивування синтезувати в підвищених кількостях переважно ті сполуки, які є цільовим (основним) продуктом даного виробництва. Ефективність тієї чи іншої мікроорганізму-продуцента для виробничих цілей визначається, з одного боку, швидкістю його зростання, з іншого - ступенем використання поживних речовин. Велике значення у своїй мають також морфологічні особливості продуцента (розміри клітин, здатність виділятися із середовища під час використання різних технологічних прийомів та інших.).
В якості сировини та субстратів для отримання мікробної біомаси в різних країнах використовують вуглеводні абоуглеводсодержащее сировину. Для великомасштабних процесів більше придатні вуглеводні: н-алкани, природний газ, як найдешевша і найдоступніша сировина. Отримання білка одноклітинних можливе також на різних відходах вуглеводов промисловості і сільського господарства: мелясі, молочній сироватці, відходах виробництва крохмалю, гідролізатах деревини, сульфітних лугах і для виробництва білкових продуктів найчастіше використовують дріжджі Candida.
Вуглеводні
н-Алкани – насичені з прямим ланцюгом вуглеводні, називають парафінами. Для отримання білка використовують вуглеводні з довжиною вуглецевого ланцюга С 9 - С 18 , одержувані з нафти та гасу. Окислювати вуглеводні здатні багато мікроорганізмів: бактерії, актиноміцети, дріжджі, мікроскопічні гриби. Найбільше значення мають аспорогенні дріжджі Candida, Rhodotorula, Torulopsis.
Метан – найдешевший вид сировини для білка. Метан використовують лише бактерії, та його культивування пов'язані з низкою труднощів: вибухонебезпечність (метан утворює з киснем вибухонебезпечну суміш), низька розчинність метану в культуральної рідини, повільне зростання мікроорганізмів та його підвищена потреба у кисні. До облігатних метанотрофів відносять бактерії пологів Methylobacter, Methylococcus, Methylomonas.
Вуглеводовмісні субстрати
Меласса – побічний продукт виробництва цукру з цукрової тростини та цукрових буряків, багатий на вуглеводи, цінні органічні та мінеральні речовини, амінокислоти, вітаміни. Вміст сахарози до 60%.
Молочна сироватка - дуже багата на різні біологічно активні сполуки, вона містить у середньому 70-80% лактози, 7-15% білкових речовин, 2-8% жиру, 8-10% мінеральних солей. Крім того, молочна сироватка має у своєму складізначна кількість вітамінів, гормонів, органічних кислот, мікро- та ультрамікроелементи.
Наявність у молочній сироватці легко засвоюваних багатьма видами мікроорганізмів джерел вуглецю, а також різних ростових факторів висуває її в ряд найбільш цінних поживних середовищ для одержання продуктів мікробного синтезу. Велике значення має й та обставина, що застосування молочної сироватки не потребує спеціальної складної підготовки, а культуральна рідина після вирощування мікроорганізмів може бути використана у харчових та кормових цілях без обробки.
При всебічному використанні мікробної маси, отриманої на молочній сироватці, було виявлено її високу технологічну та економічність для м'ясного та молочного тваринництва, птахівництва та цілого ряду інших напрямків.
ПОРЯДОК ВИКОНАННЯ РОБОТИ
П е р в о е за н я т і е
1. Визначення рН живильного середовища.
2. Визначення титрованої кислотності живильного середовища.
3. Визначення вмісту сухих речовин у поживному середовищі.
4. Визначення амінного азоту.
5. Приготування посівної суспензії та засів живильного середовища.
Установка колб на качалки.
Визначення рН живильного середовища
Проводять за допомогою іономіру.
Визначення титрованої кислотності живильного середовища
У колбу на 100 мл відбирають 10 мл молочної сироватки, додають 20 мл дистильованої води, 3-4 краплі фенолфталеїну і відтитрують 0,1 н розчином NaOH до слабо-рожевого забарвлення.
Титровану кислотність живильного середовища (К), у градусах Тернера, розраховують за формулою:
де К – титрована кислотність, Т; V 1 - об'єм 0,1 н розчину NaOH мл, що пішов на титрування 10 мл живильного середовища; 10 - коефіцієнт перерахунку на 100 млживильного середовища.
Визначення вмісту сухих речовин у поживному середовищі
Проводять за допомогою рефрактометра.
Визначення амінного азоту живильного середовища йодометричним
У мірну колбу об'ємом 50 мл піпеткою вносять 10 мл молочної сироватки, додають 3-4 краплі тимолфталеїну і краплями 1 н розчин NaOH до появи блідо-блакитного забарвлення. До лужного розчину з циліндра при помішуванні доливають 30 мл суспензії фосфату міді, вміст колби доводять водою до мітки, перемішують і фільтрують через щільний фільтр. Фільтрат має бути абсолютно прозорим. 10 мл фільтрату піпеткою переносять у конічну колбу, додають 0,5 мл оцтової кислоти, 1 г йодиду калію та перемішують. Йод, що виділився, титрують з мікробюретки 0,01 н розчином тіосульфату натрію, додаючи в кінці титрування 1-2 краплі розчину крохмалю. Закінчення титрування визначають за зникненням синього забарвлення.
Кількість амінного азоту (Х) обчислюють за формулою:
а 0,28 V 10 100
де Х – кількість амінного азоту, мг/100 мл; а - кількість 0,01 н розчину тіосульфату натрію, що пішло на титрування, мл; V – обсяг досліджуваної рідини, взятий на аналіз, мл.
Приготування посівної суспензії та засів живильного середовища
Проводять так само, як і у попередніх роботах.
Установка колб у термостат
Кожну колбу підписують (група, прізвище, тривалість культивування) і встановлюють термостат на 3, 5, 7 діб при температурі 25-27°С.
В т о р о е з а н і т і
1. Визначення приросту біомаси гриба-продуцента.
2. Визначення рН культуральної рідини.
3. Визначення титрованої кислотності культуральної рідини.
4. Визначення вмісту сухих речовин у культуральній рідині.
5. Визначення амінного азоту в культуральній рідині.
6. Визначення білка в біомасі колориметричним способом.
Заповнення журналу спостережень.
Визначення приросту біомаси гриба-продуцента
На аналітичних терезах зважують попередньо висушені до постійної маси фільтри. Вміст колб фільтрують через фільтр, при цьому біомасу, що виросла, гриба шпателем переносять на фільтр. Біомасу на фільтрі сушать у сушильній шафі при температурі 130С протягом 1 години. Висушені таким чином фільтри з біомасою охолоджують в ексикаторі та зважують на аналітичних вагах. Масу сухого міцелію (В), г розраховують за формулою:
В = В 2 - В 1 (4.3)
де 1 - маса порожнього фільтра, г; У 2 - маса фільтра з біомасою, р.
Визначення рН культуральної рідини
Проводять за допомогою іономіру.
Визначення титрованої кислотності культуральної рідини
У колбу на 100 мл відбирають 10 мл відфільтрованої рідини, додають 20 мл дистильованої води, 3-4 краплі фенолфталеїну та відтитрують 0,1 н розчином NaOH до слабо-рожевого фарбування. Кислотність розраховують так само, як і на першому занятті.
Визначення вмісту сухих речовин у культуральній рідині
Проводять за допомогою рефрактометра.
Визначення амінного азоту в культуральній рідині
Проводять йодометричним методом (див. перше заняття).
Визначення білка колориметричним методом
Близько 0,5 г досліджуваного подрібненого в борошно зразка зважують на аналітичних вагах з точністю до + 0,001г і поміщають у конічну колбу місткістю 250 см 3 з пробкою. У колбу додають піпеткою 50см 3 розчину гідроксиду натрію концентрацією 0,1 мольдм 3 . Колбу закривають пробкою і струшують намеханічному струшувачі протягом 15 хв. Потім центрифугують витяжку 10 хв. при частоті обертання 6000 хв -1. 5 см 3 прозорого центрифугату піпеткою переносять у мірну колбу на 50см 3 і вміст колби доводять до мітки сульфосаліцилової кислоти. Паралельно готують контрольний зразок. Для цього 5см 3 дистильованої води переносять у мірну колбу на 50см 3 і вміст колби доводять до мітки сульфосаліцилової кислоти.
При нефелометричному аналізі отримання точних результатів залежить від порядку та швидкості змішування розчинів. Тому після додавання сульфосаліцилової кислоти колби швидко перевертають 2-3 рази (не більше), розчини наливають у кювети з товщиною шару 5мм та вимірюють величину оптичної щільності розчинів при довжині хвилі 550 нм. Виміри слід проводити одразу після додавання кислоти, т.к. частинки білка швидко агрегують. За величиною оптичної щільності білкової витяжки визначають масову частку білка за допомогою калібрувального графіка (рис.4.1).
Масову частку білка (Х, %) розраховують за такою формулою:
Мал. 4.1 Калібрувальний графік визначення білка
Заповнення журналу спостережень
Результати досліджень вносять до таблиці 4. На підставі даних таблиці побудувати графіки приросту біомаси (рис. 4.2.) та накопичення білка в біомасі (рис. 4.3) у процесі культивування гриба-продуцента.
На підставі отриманих результатів роблять висновок про здатність гриба Penicillium roqueforti продукувати білок на молочній сироватці, і визначають, на яку добу відбувається максимальний приріст біомаси та накопичення білка.
Контрольні питання
Які вимоги висуваються до мікроорганізмів-продуцентів?
2.Чому молочна сироватка часто використовується як живильне середовище?
У чомусутність визначення білка колориметричним методом?
Як визначити масу сухого міцелію?
Промислова мікробіологія: Навч. Посібник для вузів/З.А. Аркадєва, А.М. Безбородов, І.М. Блохіна та ін; За ред. Н.С. Єгорова.- М.: Вищ. Шк., 1989. - 688 с.
Воробйова Л.І. Технічна мікробіологія: Навч. Посібник. - М.: Вид-во Моск. Ун-та, 1987. - 168 с.