ВПЛИВ РІЗНИХ КОМПОНЕНТІВ СЕРЕДОВИЩА КУЛЬТИВУВАННЯ НА ПРОДУКЦІЮ РЕКОМБІНАНТНИХ АНТИТЕЛ У СНО
Останніми роками постійно зростає кількість рекомбінантних антитіл, схвалених для терапевтичного застосування. Зростання потреб у виробництві фармацевтичних препаратів біологічного походження стимулюють розвиток досліджень, спрямованих на підвищення продуктивності клітинних ліній ссавців, у яких одержують понад 60 % рекомбінантних терапевтичних білків. Незважаючи на розвиток інших способів експресії, саме біосинтез терапевтичних білків у клітинах ссавців залишається пріоритетним вибором, оскільки дозволяє отримати біологічно-активні білки в нативній конформації за рахунок правильного фолдингу та посттрансляційної модифікації. Однією з найпоширеніших клітинних ліній ссавців у фарміндустрії є клітинна лінія СНТ (клітини яєчників китайського хом'ячка), яка протягом багатьох років є найбільш вивченим та стабільним об'єктом при виробництві рекомбінантних білків. Перевагою використання СНТ клітин у порівнянні з іншими клітинами, такими як NS0 (клітини мієломи миші), BHK (клітини нирок дитинчат хом'яка), HEK-293 (ембріональні клітини нирок людини), є їх хороші характеристики при трансфекції, подальшій ампліфікації та селекції високопродуктивних клонів . Крім того, СНТ клітини мають здатність давати високу щільність при вирощуванні в суспензії, не утворюючи кластерів і осідання на дно [7]. Поряд із удосконаленням промислових способів одержання білків, велике значення має розробка експрес-методів підвищення рівня продукції рекомбінантних білків при культивуванні в лабораторних умовах. Одним із способів збільшення експресії необхідного продукту є застосування різноманітних добавок до середовища культивування.
Одним із факторів, що дають позитивний ефект,є штучне створення «стресових» умов культивування [3]. Однак така дія проводиться тільки після того, як культура клітин досягла оптимальної концентрації. Особливе значення при отриманні високої продуктивності клітинних ліній мають розробки щодо застосування різних добавок, таких як сіль натрієва вальпроєвої кислоти (Na-VPA) або її аналога - натрію бутирату (NaBu), а також солей цинку.
Солі Na-VPA або NaBu широко застосовують для отримання високої експресії рекомбінантних білків [3]. Одним із найбільш очевидних факторів, що призводять до таких результатів, є ацетилювання гістонів. Ацетилювання ядерних гістонів робить основний вплив на складання хроматину, але при цьому також пригнічує ріст клітин і викликає клітинний апоптоз [4].
Цинк, ймовірно, блокує апоптоз у клітинах людини за певних умов [5], а також сприяє збільшенню стабільності мРНК або за допомогою зміни вторинної структури, або, сприяючи приєднанню до мРНК стабілізуючих білків [1, 2]. Позитивних результатів було досягнуто при застосуванні низьких концентрацій сульфату цинку. Особливо це було продемонстровано для продукції рекомбінантного інтерферону-гамма. Присутність таких добавок, як ZnSO4 і NaBu, разом із зниженням температури вирощування здатне збільшити вихід продукції від 2 до 8 разів [9].
Також одним із необхідних компонентів середовища для вирощування клітин ссавців є глутамін. Однак метаболізм глутаміну викликає акумуляцію амонію у клітинній культурі. Підвищення концентрації амонію вище 2 мМ негативно впливає як на зростання клітин, так і на продуктивність рекомбінантних білків. Зменшення концентрації глутаміну в середовищі для зростання CHO клітин покращує життєздатність клітин,як наслідок, продукцію рекомбінантних білків [6]. Подовження періоду життєздатності клітин пов'язане з супресією росту та арештом клітинного циклу, що було підтверджено молекулярними дослідженнями.
Мета дослідження
Дослідження впливу натрієвої солі вальпроєвої кислоти, сульфату цинку, а також глутаміну на експресію рекомбінантних антитіл у клітинах СНТ.
Матеріали та методи
Трансфекцію суспензійної клітинної лінії CHO DG44 проводили за допомогою трансагенту реагенту FreeStyle Max Reagent (Invitrogen). Для трансфекції використовували плазміди pOptiVEC-L і pcDNA3.3-H, що містять гени легкого та важкого ланцюгів химерного антитіла до ФНП-альфа. Клітини після трансфекції вирощувалися на селективному безсироватковому середовищі CD OptiCHO. Вимірювання концентрації клітин та їхньої життєздатності проводилося з використанням 0.04 % розчину трипанового синього в камері Горяєва. Після досягнення щільності клітин 1.7х10 6 кл/мл і 90 % життєздатності клітини були посіяні в 30 мл повного середовища CD OptiCHO в концентрації 1x10 5 кл/мл у 125 мл флакони.
Через 48 год вирощування при 37 °С, 8 % СО2, 130 об/хв культуру додавали стерильний 25 мМ розчин Na-VPA в ДМСО до кінцевої концентрації 0; 2.0; та 2.5 мМ. Стерильний 2 мМ розчин цинку сульфату в 1х розчині ФБС додавався в кінцевих концентраціях 0; 50; 100 мкМ. Середа замінювалася кожні 2-3 дні.
Проби для аналізу методом ІФА були відібрані на 3-й та 6-й день інкубації. Концентрацію імуноглобулінів у культуральному середовищі визначали методом непрямого сендвіч-ІФА за стандартною методикою.
Аналіз транзієнтної експресії адгезійної культури СНТ проводили в середовищі IMDM у присутності 0.5% діалізованої сироватки плодів корови (DFBS).
Для селекції клонів, що стабільно продукуютьантитіла, використовували автоматичний флуоресцентний клітинний сортер ClonePix FL, а для оцінки конфлюентності CloneSelect Imager (обидва прилади виробництва фірми Genetix, Великобританія). Відбір трансфектантів з найкращою експресією антитіл проводився за допомогою клональної селекції на напівтвердому середовищі (Semi-Solid Media, Invitrogen, США) за методикою, запропонованою виробником.
Результати та обговорення
ВпливNa- солі вальпроєвої кислоти (Na-VPA) , сульфату цинку та їх комбінацій на продукцію антитіл уCHO клітинах .
Експерименти дослідження впливу Na-VPA і сульфату цинку проводили на культурі клітин СНО, що транзієнтно експресує рекомбінантні антитіла до ФНП-альфа. Для визначення впливу Na-VPA клітини після трансфекції вирощувалися на селективному безсироватковому середовищі CD OptiCHO у концентрації 1 x10 5 кл/мл у 125 мл флаконах. Через 48 год вирощування культуру була додана Na-VPA в кінцевій концентрації 2.5 мМ. Проби для аналізу методом ІФА були відібрані на 3-й та 6-й день інкубації. На малюнку 1 представлені результати ІФА зразків середовища, отриманих у присутності Na-VPA та у контрольних умовах (середовище OptiCHO без добавок).
Рисунок 1. Вплив Na-VPA на рівень транзієнтної експресії антитіл клітинами СНТ
Додавання Na-VPA до кінцевої концентрації 2.5 мМ більш ніж на 20 % підвищує продуктивність суспензійної клітинної культури на 6-7 день інкубації порівняно з контрольними умовами. Більше тривале вирощування призводить до зниження продуктивності за рахунок швидкої загибелі клітин.
Вплив сульфату цинку окремо, а також у комбінації з Na-VPA проводили на адгезійних трансфекованих клітинах СНТ. Після проведення трансфекції клітини були посіяні в лунки 24-лунковогопланшета в середу IMDM + 0.5% DFBS у кількості 2х105 клітин на лунку. Після досягнення клітинами конфлюентності 90% середовище було замінено на нове, що містить різні варіанти концентрацій Na-VPA та сульфату цинку. Проби для аналізу методом ІФА було відібрано через 48 годин інкубації з добавками.
Результати ІФА зразків культурального середовища. Таблиця 1