Вплив захворювань щитовидної залози на процес клітинного старіння, EUROLAB, Наукові статті
Старіння - багатопричинний процес, що викликається багатьма факторами, дія яких повторюється і накопичується протягом усього життя. Старіння призводить до функціональної неповноцінності клітин різного типу. Більше того, глибокі вікові зміни метаболізму, функції та структури закінчуються не тільки функціональною дефектністю клітин, а й зрештою призводять до їхньої загибелі. Однак навіть функціонально однорідні клітини старіють у неоднаковому темпі. Серед того самого класу клітин — нервових, м'язових, печінкових, ендокринних та інших. — можна назвати клітини з грубими порушеннями структури та функції, з вираженими ознаками гіперфункції, комплексом адаптаційних реакцій [1]. Так, у багатьох клітинах відзначається зменшення ядерно-цитоплазматичного розмаїття; числа мітохондрій, їх набухання, порушення репарації та реплікації ДНК, зменшення числа рибосом. Первинні механізми старіння пов'язані з порушенням генної регуляції. Її зміни ведуть до зсуву співвідношення різних білків, зниження потенційних можливостей систем, що білоксинтизують. З віком у соматичних клітинах накопичуються як мутації, а й хромосомні перебудови. Вважають, що зміни хроматину можуть відігравати головну роль у пов'язаних із віком змінах регуляції генів [2]. У процесі старіння центральне місце займає саме накопичення генетичних ушкоджень у клітині, тоді як імунологічні, гормональні та метаболічні ушкодження розглядаються як допоміжні. Однією з причин накопичення пошкоджень ДНК із віком може бути зниження ефективності систем репарації ДНК. Клітинне старіння супроводжується різноманітними хромосомними змінами: порушення числа хромосом, внутрішньогруповіваріації кількості хромосом; структурні зміни хромосом; поява маркерних хромосом-аберацій. Старіння клітин, можливо, пов'язане з появою спонтанних хромосомних аберацій. Хромосомна нестабільність при старінні призводить до появи великої кількості клітин з різними кількісними та структурними порушеннями, що виникають при хромосомних абераціях [3]. Вважають, що зміни хроматину можуть відігравати головну роль у пов'язаних із віком змінах регуляції експресії генів. При старінні відбувається порушення процесів транскрипції та трансляції. Молекулярні події, що визначають транскрипцію, мають вирішальне значення щодо механізмів старіння, оскільки регуляція експресії генів докорінно впливає старіння і старечі зміни.
Мета роботи: вивчення структурно-функціональних порушень хромосом та хромосомних аберацій, що виникають у клітинах щитовидної залози (ЩЗ) при старінні.
Матеріали та методи досліджень
Полірибосоми та ДНК виділяли з клітин ЩЗ та крові людей з різними формами тиреоїдної патології. Нами було створено три вікові групи людей без патології ЩЗ та при деяких формах тиреоїдної патології:
- 1-я група - 10 осіб у віці 45-55 років;
- 2-я група - 12 осіб у віці 55-65 років;
- 3-я група - 8 осіб у віці 65-75 років.
Контрольна група - 12 осіб віком 25 років.
Для виділення сумарних полірибосом з клітин ЩЗ ми застосували магнієвий метод виділення полірибосом [4], за допомогою якого вдалося досягти їх оптимального виходу. В основі методу лежить відкрита Такана [5] властивість полірибосом преципітувати з розчину під дією високих концентрацій магнію. Сумарну РНК виділяли SDS-фенолхлороформним методом. Виділеннявисокомолекулярної ДНК із лейкоцитів крові людини здійснювали методом фенольної екстракції [6]. Культивування лімфоцитів проводили в середовищі для культивування, що складається (з розрахунку на 1 флакон) з: 6мл середовища RPMI 1640 з глутаміном («ПАНЕКО», Україна), 1 мл ембріональної телячої сироватки (пр-во Франція-Німеччина), 40мкг і 20мкг/мл мітогену - фітогемагглютініна (ФГА DifcоP), додавали 0,8мл цільної крові. Препарати фарбували 4% розчином Романівського – Гімза. Аналіз проводили у стадії метафази. Ядра з клітин ЩЗ виділяли осадженням в 0,25М сахарозі, що містить 5мМ MgCl2, 1 мМ дитіотрейтолу (ДТТ), 10 мМ трис-HCI pH7,5, і проводили очищення ядер шляхом нашарування на розчин 2М сахарози в буфері Б (24 00 хв 1 год, ротор SW 27). Для визначення ДНКаза-чутливості обробляли ядра ДНКазою 1 (2000 Од/мг Serva), інкубували при 4°С протягом 5 хв з різними концентраціями ДНКази I (від 0,1 до 100 Од/мл) або з фіксованою концентрацією ферменту (20 Од /мл) при 37 ° С протягом 15 хв. Виділення фракцій ДНК із клітин крові проводили модифікованим фенольним методом, що дозволяє виділити три фракції ДНК завдяки застосуванню різних умов депротеїнізації. Комплементарну ДНК для гена ТГ синтезували методом полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) на 0,5мкг сумарної РНК у присутності зворотної транскриптази із застосуванням праймерів, специфічних для гена ТГ: 51-AGGCTAGGAAAATGGCCCTGGTCC-31 та 51-GTGG ПЛР проводили в інкубаційному середовищі: 50 мкл містили 60мМ трис-НС1 (рН 8,6), 6 мМ ЕДТА, 10 мМ b-меркаптоетанол, 10мкг/мл ВСА, 1 мМ кожного з 4 нуклеотидів, 2 од. зворотної транскриптази. ПЛР мала лише 55 циклів. Синтез проводили при 72 С протягом 4хв. Наступні цикли включали денатурацію (1хв, 49°С), відпал праймерів (1хв, 55 ° С), синтез кДНК (2 хв, 72 ° С). Після 55 циклів ампліфікації проби витримували 10 хв при 72 °С і потім охолоджували, відбирали аліквоти, ставили електрофорез кДНК для гена ТГ в 1% агарозі з бромистим етидієм.
Результати досліджень та їх обговорення
З віком секреторна функція ЩЗ знижується. Зниження активності ЩЗ в онтогенезі виявляється у зменшенні органіфікації йоду та гормоноутворення. Чутливість гіпоталамо-гіпофізарного комплексу до інгібуючого впливу трийодтироніну зменшується, що сприяє підвищенню рівня тиреотропного гормону (ТТГ) у здорових людей похилого віку. Зниження гормоноутворення з віком можливо пов'язане з порушенням регуляції експресії гена ТГ у людей похилого віку. Очевидно, порушення регуляції експресії гена ТГ пов'язані з структурно-функціональними змінами хроматину. Було проведено вивчення структурно-функціональних змін хроматину та ролі різних модифікацій у ДНК при старінні (функціональна активність різних фракцій ДНК, ДНКаза I-гіперчутливість хроматину ядер). ДНКаза I-гіперчутливі сайти локалізовані у фланкуючих (51- або 31-) областях активних генів. Вони відображають структурні варіації у хроматині, характер яких досі не з'ясований. Поява гіперчутливих сайтів передує початку транскрипції та пов'язана з транскрипційною активністю. Виходячи з вищесказаного, цікавило вивчити вплив відмінностей у ступені експресії гена ТГ при клітинному старінні на структуру хроматину.
Проведено вивчення ДНКазу I-гіперчутливості хроматину клітин ЩЗ у людей похилого віку при різній тиреоїдній патології. Як контроль були використані люди похилого віку без порушень ЩЗ. У цьому випадку ядра виділяли з епітеліальних клітин слини.пацієнтів. Було досліджено 70 людей похилого віку. На рис. 1 наведено дані щодо ДНКазу I-гіперчутливості хроматину ядер літніх людей без патології ЩЗ та при вузловому еутиреоїдному зобі (УЕЗ). З наведених даних видно, що існує пряма кореляція між ступенем експресованості гена ТГ і ДНКаза I-гіперчутливістю хроматину ядер ЩЗ літніх при вузловому зобі еутиреоїдному, тобто. експресовані гени є більш чутливими до ДНКази, ніж неактивні гени. Для розуміння експресії гена ТГ важливе значення має з'ясування структурної організації функціональних властивостей транскрипційно-активних ділянок геному. З'ясування чинників, визначальних потенційно активний стан гена ТГ, надзвичайно важливе розуміння молекулярних механізмів регуляції експресії даного гена у процесі клітинного старіння [7].
З лейкоцитів крові людей без патології ЩЗ та при вузловому еутиреоїдному зобі методом диференціальної бездетергентної фенольно-сольової депротеїнізації виділено три фракції ДНК: ДНК I, ДНК II, ДНК III. Фракція ДНК I охарактеризована як транскрипційно активна ДНК, фракція ДНК II є ДНК стабільно репресованих ділянок геному, ДНКIII- потенційно активні ділянки геному.
Прямі докази функціональних відмінностей ДНК I, ДНК II та ДНК III були отримані при вивченні вмісту послідовностей гена ТГ у фракціях методом молекулярної гібридизації цих фракцій з надлишком 3Н ТГ кДНК. Методом ПЛР була синтезована ТГ кДНК. Для синтезу кДНК гена ТГ використовували як ДНК-полімеразу I, так і РНК-залежну ДНК-полімеразу (ревертазу). Синтезований препарат ТГ кДНК був використаний нами як зонд в експериментах з гібридизації.
При гібридизації фракції ДНК III з 3Н ТГ кДНК гібридизується вконтролі склала 23%. У людей віком 55, 65 та 70 років відсоток гібридизації склав 18, 11 та 6 % відповідно. Зміст послідовностей гена ТГ у фракції ДНК III при старінні клітин зменшується в 3,8 рази. При вивченні вмісту послідовностей гена ТГ у фракціях ДНК I, ДНК II та ДНК III у людей старшої вікової групи без патології ЩЗ відмінності у вмісті послідовностей гена ТГ у цих фракціях було незначним. На рис. 2 наведено дані щодо вмісту послідовностей гена ТГ у фракціях ДНК I та ДНК III.
З даних видно, що фракція ДНК I більш збагачена послідовностями гена ТГ у клітинах ЩЖ у контролі, тобто. доведено, що фракція ДНК I є транскрипційно активною.
Для підтвердження отриманих даних нами було проведено цитогенетичний аналіз хромосомних аберацій на стадії метафази мітозу лімфоцитів периферичної крові у молодих людей (18 років та 24 роки) та людей віком 54, 69 та 75 років. У табл. 1 наведено дані щодо вивчення хромосомних аберацій у лімфоцитах периферичної крові людей різного віку.
Необхідно відзначити, що люди старшої вікової групи були з патологією ЩЗ: 54 та 69 років – з дифузним токсичним зобом та 75 років – з вузловим еутиреоїдним зобом.
У цих культурах ми вивчали рівень спонтанних хромосомних аберацій у клітинах лімфоцитів периферичної крові. З табл. 1 видно, що кожну культуру аналізували щонайменше 100 метафаз з хорошим розкидом хромосом. У пацієнтів віком 50 років загальна кількість вивчених метафаз становила 123 клітини, серед яких одна клітина з одним мікрофрагментом (0,8%); у пацієнтів віком 69 років загальна кількість вивчених метафаз становила 111 клітин, одна клітина — з парним фрагментом (0,9%). У пацієнта віком 75 років звузловим еутиреоїдним зобом загальна кількість вивчених метафаз становила 156 клітин, з них 3 (1,92%) - аберантні клітини з парними фрагментами. Аберантні клітини у даного пацієнта перевищують кількість аберантних клітин у контролі (18 років та 24 роки).
Нами проведено цитогенетичний аналіз хромосом клітин лімфоцитів периферичної крові людей вікової групи без патології ЩЗ (59–75 років). Цитогенетичний аналіз хромосом клітин лімфоцитів периферичної крові віком 75 років без патології ЩЗ виявив поодинокі асиметричні транслокації хромосом.
Відомо, що структурні аберації хромосом відносяться до того типу генетичних порушень, які роблять свій внесок у багатофакторний процес старіння. Нестабільні хромосомні аберації – дицентрики, кільця, фрагменти – призводять до загибелі клітин, стабільні – транслокації, інсерції – можуть впливати на процес клітинного старіння. На підставі отриманих даних можна зробити висновок, що незалежно від патології ЩЗ при старінні спостерігаються різні хромосомні аберації.
1. Встановлено наявність прямої кореляції між ступенем експресованості гена ТГ у тиреоїдних клітинах у процесі клітинного старіння та ДНКази I-гіперчутливістю.
3. Встановлено, що при вузловому еутиреоїдному зобі у пацієнта віком 75 років спостерігаються невеликі хромосомні аберації.
4. Показано, що у пацієнтів віком 75 років без патології щитовидної залози спостерігаються поодинокі асиметричні транслокації хромосом.
Література1. Recves D. Molecular mechanisms of aging // Experim. Cell. Researh. - 1998. - Vol. 185. - P. 277-283.2. Recves D. Trancriptionally active chromatin // Biochem. Biophys. Acta. - 1999. - Vol. 782. - P. 343-393.3. Sanchez-Cespedes M., Monzo M., Rosell R. та ін. Detection of chromosome 3palterations in serum DNA для невеликих маленьких пацієнтів пацієнтів // Ann Oncol. - 1998. - № 9. - P. 113-116.4. Лейтін В.Л., Лерман М.І. Вивчення полірибосом із клітин печінки щурів. Препаративний метод одержання полірибосом // Біохімія. - 1969. - Т. 34. - С. 839-841.5. Takanami M. Стальний рибонуклеоproteín для аміноацидної сировини // Biochim. Biophys. Acta. - 1960. - Vol. 39. - P.318-322.6. Дашкевич В.С., Аршинова Т.В. Виділення фракцій ДНК печінки щурів, що реплікується, бездетергентним фенольним методом // Біологія. - 1963. - Вип. 43, т. 15. - С. 133-136.