Засіб, що збільшує резерв стовбурових клітин в організмі
Власники патенту UA 2405822:
Винахід відноситься до галузі біотехнології та медицини, безпосередньо до створення за допомогою нанотехнології радіоційного синтезу засобу, що збільшує резерв стовбурових клітин в організмі і має низьку імуногенність, і може бути використане в регенеративної медицини. Засіб являє собою гіалуронідазу, іммобілізовану на полімері, шляхом її внесення в розчин низькомолекулярного водорозчинного полімеру, попередньо підданого впливу іонізуючого випромінювання в дозі 1-5 Мрад, до кінцевої концентрації 70 ОД в 1 мл. Винахід дозволяє отримати іммобілізовану гіалуронідазу, яка характеризується значним підвищенням її здатності збільшувати резерв стовбурових клітин в організмі та ефективна як при парентеральному, так і при пероральному введенні. 4 табл.
Винахід відноситься до галузі експериментальної біології та медицини, безпосередньо до фармакології та клітинних технологій, і може бути використане в регенеративній медицині.
Існують способи збільшення вмісту клітин-попередників різних класів у певних тканинах за допомогою лінійно-рестриктованих та ранньодіючих факторів росту [1].
Відома можливість збільшення резерву стволових клітин в організмі за допомогою препарату нативної гіалуронідази [2, 3].
Недоліками цього засобу є побічні ефекти та ускладнення [4, 5], пов'язані з імуногенністю гіалуронідази, що є білковим препаратом. Зокрема, системні та місцеві алергічні реакції різної інтенсивності (аж до анафілактичного шоку) при її парентеральному введенні, що є єдиним можливим шляхом призначення даного ферменту. У зв'язку з цим важливе значення набуваєпроблема створення засобу, що має здатність збільшувати резерв стовбурових клітин в організмі, при використанні якого були б побічні ефекти, що спостерігаються при парентеральному застосуванні нативної гіалуронідази.
Завданням, вирішуваним даним винаходом, є створення засобу, що збільшує резерв стовбурових клітин в організмі, що не має імуногенності, ефективного як при парентеральному, так і при пероральному введенні.
Поставлене завдання досягається іммобілізацією гіалуронідази на носіях низької молекулярної маси на носіях за допомогою іонізуючого випромінювання. Як носій використовуються біологічно індиферентні речовини - водорозчинні полімери з молекулярною масою 400-4000 Так.
Найбільш переважним способом іммобілізації є вплив на полімерний носій та біологічно активне з'єднання спрямованим потоком прискорених електронів з енергією електронів 2,5 МеВ, поглинена доза від 2 до 10 кГр, швидкість набору дози 1,65 кГр/год.
Як водорозчинний полімер використовують поліетиленгліколь, гідроксиетилкрохмаль, полівінілпіролідон та ін. з молекулярною масою від 400 до 4000 Да.
Новим у пропонованому винаході є створення засобу, що представляє собою гіалуронідазу, іммобілізовану за допомогою іонізуючого випромінювання, що збільшує резерв стовбурових клітин в організмі, що не має імуногенності, та ефективного як при парентеральному, так і при пероральному введенні.
Використовуване нами оригінальне засіб іммобілізованої за допомогою іонізуючого випромінювання на низькомолекулярному носії гіалуронідази було розроблено та отримано НДІ фармакології СО РАМН (Томськ) спільно з ТОВ «Саентифік Ф'ючер Менеджмент» (Новосибірськ).
В даний час дужеперспективними лікування різних захворювань виглядають способи клітинної терапії. При цьому найбільш фізіологічним та доцільним підходом до вирішення задач регенеративної медицини є фармакологічна стимуляція ендогенних стовбурових клітин (СК) [6]. Разом з тим регулятори функцій СК у переважній більшості є білковими сполуками, застосування яких як препарати для системного використання значно обмежене внаслідок їх високої імуногенності [4, 5]. Відомі способи подолання імуногенності білкових препаратів за допомогою глюкокортикоїдних гормонів, антигістамінних засобів та ін. Однак використання даних препаратів найчастіше супроводжується розвитком небажаних побічних ефектів та ускладнень, характерних для них самих [6, 7].
У той самий час значне зниження імуногенності речовин спостерігається при ентеральному прийомі лікарських засобів. Однак засоби білкового походження в шлунково-кишковому тракті розщеплюються під впливом протеолітичних ферментів, що робить даний шлях їх введення в організм неефективним. У той же час існують дані про зниження імуногенності та підвищення стійкості білків до протеаз при їх іммобілізації на низькомолекулярних носіях [8]. Відомий препарат - лонгідаза, що є кон'югатом гіалуронідази («Лідаза») і поліоксидонія, одержуваний шляхом хімічного синтезу [9]. Тим не менш, відомостей про можливість зменшення імуногенних властивостей гіалуронідази, а також способу створення препарату з високою гіалуронідазною активністю, ефективного, у тому числі при прийомі внутрішньо, за рахунок іммобілізації молекул ферменту на носіях низької молекулярної маси з використанням іонізуючого випромінювання, на сьогоднішній день не існує. Більше того, немає данихпро фармакологічні переваги препаратів, отриманих в результаті іммобілізації біологічно активних речовин за допомогою іонізуючого випромінювання, перед сполуками, що утворюються при кон'югуванні тих самих вихідних субстанцій, але хімічним шляхом. Тобто не відомо існування якісних відмінностей кінцевого продукту, пов'язаних із способом його одержання: технології хімічного синтезу (за допомогою якої одержують лонгідазу) та електронно-променевою технологією іммобілізації (за допомогою якої здійснюється одержання запропонованого засобу). У той же час відомо, що процес маніпуляції різнорідними субстанціями на молекулярному рівні [10, 11], у тому числі з використанням фізичних факторів, що мають високу енергію, може супроводжуватися суттєвими змінами стереохімічної структури вихідних речовин, і врешті-решт призводити до модифікації їх властивостей , характер якої найчастіше є непередбачуваним.
Факт іммобілізації гіалуронідази на носії за допомогою іонізуючого випромінювання з досягненням нового технічного результату: створення засобу, що збільшує резерв стовбурових клітин в організмі, що не має імуногенності та ефективного при парентеральному та пероральному прийомі, для фахівця є не очевидним.
Суттєві ознаки, що заявляються, виявили в сукупності нові властивості, що не випливають явно з рівня техніки в даній галузі. Пропонований винахід може бути використаний в експериментальній біології та медицині з виходом у практичну охорону здоров'я. Ідентичної сукупності ознак щодо рівня техніки з патентної і науково-медичної літератури не виявлено.
Виходячи з вищевикладеного, слід вважати технічне рішення, що заявляється, відповідним критеріям: «Новизна», «Винахіднийрівень», «Промислова застосовність».
Експерименти були проведені на мишах-самцях лінії CBA/CaLac у кількості 106 штук, масою 18-20 г, 27 морських свинках обох статей масою 200-250 г. Тварини отримані з розплідника відділу експериментального біомедичного моделювання НДІ фармакології.
10% водний розчин поліетиленгліколю з молекулярною масою 400 Так опромінювали потоком прискорених електронів на дозі 1,5 Мрад. Обробку проводили гальмівним випромінюванням, що генерується прискорювачем ІЛУ-6 з енергією електронів 2,5 МеВ, поглинена доза від 2 кГр, швидкість набору дози 1,65 кГр/год. В опромінений розчин вносили гіалуронідазу («Лідаза», ФГУП «НВО Мікроген» МОЗ РФ) до кінцевої концентрації 70 ОД гіалуронідази в 1 мл 10% поліетиленгліколю. Суміш перемішували 10 хвилин і отримували кінцевий іммобілізований препарат у вигляді опалесцентного розчину. Вихід готового товару становить 96,2%.
5% водний розчин гідроксиетил-крохмалю з молекулярною масою 1,5 кДа опромінювали потоком прискорених електронів у дозі 1,5 Мрад. Обробку проводили гальмівним випромінюванням, що генерується прискорювачем ІЛУ-10 з енергією електронів 2,5 МеВ, поглинена доза 10 кГр, швидкість набору дози 1,65 кГр/год. В опромінений розчин вносили гіалуронідазу («Лідаза», ФГУП «НВО Мікроген» МОЗ РФ) до кінцевої концентрації 70 ОД гіалуронідази в 1 мл 5% гідроксиетил-крохмалі. Суміш перемішували 10 хвилин і отримували кінцевий іммобілізований препарат у вигляді опалесцентного розчину. Вихід готового товару становить 97,3%.
Вивчали специфічну активність імГД. Як препарат порівняння використовували «Лонгідазу» (НВО Петровакс Фарм. Україна), що є хімічним кон'югатом гіалуронідази («Лідаза») з поліоксидонієм.
Обробку результатів проводили методомваріаційної статистики з використанням t-критерію Стьюдента та непараметричного U-критерію Вілкоксону-Манна-Уітні. Частоту народження МСК в кістковому мозку і периферичної крові визначали за допомогою узагальненої лінійної моделі для розподілу Пуассона. Відповідність даних лімітуючих розведень одновимірної моделі Пуассона оцінювалося за допомогою лінійної log-log регресії. При цьому теоретична фракція негативних лунок µi розподілялася як µi=exp(-fxi), де f - частота народження MCK, xi - кількість клітин, висаджених в лунку [12]. Використовувалася програма Statistica 6.0.
Препарат іммобілізованої за допомогою електронно-променевого впливу на поліетиленкліколі гіалуронідази (імГД) у дозі 1000 Од/кг, вводили інтактним тваринам одноразово внутрішньочеревно та перорально. Контрольним мишам в еквівалентному обсязі (0,2 мл) внутрішньочеревно та перорально вводили препарат порівняння «Лонгідазу» (НВО Петровакс Фарм. Україна) у дозі 1000 Од/кг.
Введення тварин досліджуваних препаратів у всіх випадках, за винятком перорального введення препарату порівняння, призводило до суттєвого зростання вмісту досліджуваних прогеніторних елементів у кістковому мозку.
При внутрішньочеревному введенні лонгідази кількість MCK, КУО-ГЕММ, КУО-Ф і КУО-ГМ було підвищеним протягом усього експерименту і досягало максимальних значень на 5 добу досвіду.
Використання імГД призводило до значно більш виражених і тривалих змін з боку пулів прогениторних елементів, що вивчаються. Причому слід зазначити, що свою максимальну ефективність заявляє засіб виявляло щодо найбільш ранніх клітин-попередників: МСК і КУО-ГМ. Більше того, практично не спостерігалося відмінностей у групах тварин, які одержують даний препарат різними способами.(парентерально та перорально) (табл.1).
Засіб отримували шляхом іммобілізації гіалуронідази на молекулах гідроксиетил-крохмалю за допомогою різних видів іонізуючого випромінювання: 1) гама випромінювання (імГД-1); 2) ультрафіолетового випромінювання (імГД-2) та 3) лазерного випромінювання (імГД-3). Препарати іммобілізованої ГД (ТОВ «Саентифік Ф'ючер Менеджмент», Новосибірськ) в дозі 50 Од/кг вводили інтактним тваринам перорально 1 раз на добу протягом 5 днів.
Введення імГД у всіх випадках призводило до значного та практично однакового збільшення вмісту ранніх (МСК, КОЕ-ГЕММ) та комітованих прогеніторних клітин (КОЕ-Ф) у гемопоетичній тканині. При цьому найбільших величин підвищення досліджуваних показників мало місце щодо МСК та КУО-ГЕММ на 8 добу досвіду (табл.2).