1985 - клонування кісткових риб 13 1996 - овечка Доллі
1998 - перша корова [15].
1999 - перший козел [16].
2001 - перша кішка [17].
2002 - перший кролик [18].
2003 - перші бик [19], мул [20], олень [21].
2004 - перший досвід клонування з комерційними цілями (кішки). [22]
2005 - перший собака (афганська хорт на прізвисько Снуппі). [23]
2006 - перший тхір
2007 - другий собака [24]
2008 - третій собака (лабрадор на прізвисько Чейс). Клонована на державне замовлення[25]. Початок комерційного клонування собак[26]
3. Методи клонування тварин
Останні десятиліття XX століття ознаменувалися бурхливим розвитком однієї з головних гілок біологічної науки - молекулярної генетики. Вже на початку 70-х років вчені в лабораторних умовах почали отримувати та клонувати рекомбінантні молекули ДНК, культивувати у пробірках клітини та тканини рослин та тварин. Виник новий напрямок генетики генетична інженерія. На основі її методології почали розроблятися різноманітні біотехнології, створюватися генетично змінені організми (ГМО). З'явилася можливість генної терапії деяких захворювань людини, а останнє десятиліття XX століття ознаменувалося ще однією важливою подією - досягнуто величезного прогресу в клонуванні тварин із соматичних клітин.
Особливо великий резонанс у світової громадськості набули дослідження шотландських учених із Рослинського Університету, яким вдалося з клітини молочної залози вагітної вівці отримати генетично точну її копію. Клонована вівця на прізвисько Доллі нормально розвивалася і народила спочатку одного, а потім ще трьох нормальних ягнят. Після цього з'явився ряд нових повідомлень про відтворення генетичних близнюків корів, мишей, кіз, свиней із соматичних клітин цихтварин. У приматів, зокрема, у мавп поки що не вдалося отримати клони з використанням клітин дорослого організму, плода або навіть ембріональних стовбурових клітин.
Проте роботи у цьому напрямі активно ведуться. Торік з'явилося повідомлення про клональне розмноження потомства приматів шляхом поділу зародка. Американським дослідникам вдалося отримати генетично ідентичні ембріони мавпи резус шляхом поділу бластомерів зародка на стадії розподілу. З ембріона народилася цілком нормальна мавпочка Тетра.
Такий тип клонування забезпечує генетично ідентичне потомство, і в результаті можна отримати двійню, трійню та генетичні близнюків. Це дозволяє проводити теоретичні дослідження щодо ефективності нових методів терапії тих чи інших захворювань, з'являється можливість повторювати наукові експерименти на генетично ідентичному матеріалі. Імплантуючи зародки послідовно одному й тому ж сурогатної самці, можна досліджувати вплив її організму в розвитку плода [31].
Розроблені методи клонування тварин поки що далеко не досконалі. У процесі експериментів спостерігається висока смертність плодів та новонароджених. Ще не зрозумілі багато теоретичних питань клонування тварин з окремої соматичної клітини.
Проте успіх, досягнутий у клонуванні вівці та мавп, показав теоретичну можливість створення генетичних копій також людини з окремої клітини, взятої з якогось його органу. Багато вчених з ентузіазмом сприйняли ідею клонування людини.
3.1 Методи трансплантації ядер
У нашій країні Б.В. Конюховим та Є.С. Платоновим в 1985 р. було розроблено метод менш травматичного перенесення ядер методом мікроманіпуляції. Він протікає у два етапи: спочаткутонкою мікропіпеткою проколюють зони пеллюциду і плазматичної мембрани і витягують пронуклеуси, а потім іншою піпеткою, більшого діаметру (12 мкм), в той же отвір вводять диплоїдне ядро донора. У цьому випадку менше травмується цитоплазма зиготи і ядро донора, що транспортується.
Трансплантація ядер може здійснюватися і в інший спосіб, з використанням цитохалазинів (речовин, що синтезуються грибами).
Цитохалазин В руйнує структуру мікрофіламентів та сприяє унікальному розташуванню ядра. Ядро залишається з'єднаним з клітиною тоненьким стеблинком цитоплазми. При центрифугуванні цей місток розривається, утворюються без'ядерні клітини (цитопласти) і каріопласти, що є ядрами, оточені тонким шаром цитоплазми і цитоплазматичної мембраною. Цитопласти відокремлюють від інтактних клітин у градієнті щільності. Вони зберігають здатність прикріплюватися до поверхні культуральної судини і можуть бути використані для злиття з каріопластами інших клітин з метою отримання життєздатної клітини [14] [12].
Методи виділення каріопластів дещо складніше і включають ряд операцій з центрифугування, поділу в градієнті щільності і т.д. У деяких випадках до суміші клітин та каріопластів додають частинки танталу діаметром 1 – 3 мкм. Вони проникають у клітини і ніколи в каріопласт, тому більш важкі клітини осаджуються швидше за каріопласти.
Цитопласти містять усі види органел, властиві нормальній клітині, зберігають здатність прикріплюватися до субстрату, утворювати складчасту мембрану, пересуватися, здійснювати піноцитоз.
Каріопласти оточені тонким шаром цитоплазми (близько 10% від усієї клітинної цитоплазми), містять компактний ендоплазматичний ретикулум, кілька мітохондрій та рибосом. У деяких клітиннихліній 1/10 каріопластів здатна відновити весь втрачений обсяг цитоплазми та відновитися у життєздатні клітини.
Для реконструкції клітин суспензію каріопластів у сольовому буфері додають до моношару культури цитопластів із пропорції 100 каріопластів на 1 цитопласт. Цитопласти повинні бути покриті інактивованими вірусними частинками. Інкубують при температурі 4°С 45 хвилин, а потім 45 хвилин при температурі 37°С. Відмивають розчином Ерла для видалення каріопластів, що не злилися [8].
3.2 SLIC (sequence and ligation-independent cloning) метод клонування
Стів Елледж та невтомна Мамі Лі вкотре порадували наукову спільноту оригінальним методом клонування. Новий метод отримав назву SLIC (sequence and ligation-independent cloning). Новинка є модифікацією відомого методу LIC (ligation-independent cloning) – клонування без використання лігази. Для того щоб вставити фрагмент ДНК у вектор за допомогою класичного методу LIC, досить змішати вектор і вставку, на кінцях яких розташовані протяжні одноланцюгові ділянки, комплементарні один одному. При цьому вставка прилипає до вектора, утворюючи рекомбінантну плазміду з ніками в обох ланцюгах. Отриманою плазмідою трансформують Е. coli, система репарації якої відновлює нормальну структуру плазміди.
Метод SLIC - це те саме, що і LIC з єдиною різницею: "злипання" вектора та вставки проводять у присутності білка RecA. Ця незначна модифікація методу дозволяє досягти досить високого виходу (1 нг. Вектора здатний дати 3900 трансформантів) а також спростити саму процедуру клонування. Так якщо для класичного методу LIC необхідно точно підігнати розмір одноланцюжкових ділянок у вектора та вставки (щоб у результаті на стикувектора та вставки вийшли ники), то метод SLIC допускає наявність протяжних гепів [19].