5.6.8. Характеристики біологічних об’єктів. Пробопідготовка
На стадії пробопідготовки зразок очищається від домішок та забруднень, які не слід відкидати, оскільки вони можуть бути джерелом додаткової інформації. Пробопідготовка – стадія ризику втратити аналізовану речовину та об'єкт. Тому всі дії, що вживаються, повинні бути логічно виправдані і спрямовані на збереження зразків, відібраних для аналізу, для подальшого дослідження.
Сеча – найпоширеніший об'єкт дослідження на лікарські токсичні сполуки та найпростіший біооб'єкт для аналізу внаслідок низького вмісту білкових компонентів.
Важливим показником сечі як біооб'єкта є рН тому робота з нею вимагає постійної уваги до зміни рН. Величина рН сечі підвищується згодом через дію бактеріальної флори, що виділяє аміак. Таке збільшення можна запобігти шляхом зберігання її за знижених температур (при аналізі дуже лабільних речовин – у замороженому вигляді). Необхідно враховувати також, що при зберіганні сечі в холодильнику відбувається новоутворення етанолу до концентрації 0,5 ‰. При цукровому діабеті новоутворення етанолу в сечі, що зберігається в холодильнику, сягає 1,1‰. Разом з тим, слід пам'ятати, що при великому обсязі повітряного шару у флаконі над кров'ю або сечею відбувається окислення алкоголю і зниження його вмісту в об'єкті.
Дію бактеріальної флори можна уповільнити додаванням натрію фториду, кислоти борної та інших бактеріостатичних препаратів, проте треба враховувати їхню подальшу участь в екстракції та утворенні фону. Сечу можна ліофілізувати, попередньо перевівши леткі сполуки у відповідні солі.
З потенційних ендогенних сполук необхідно відзначити присутність низькомолекулярних продуктів метаболізму амінокислот тацукрів (аміни, сечовина, карбонові кислоти, солі карбонових кислот та ін), невеликих кількостей пептидів та цукрів (у нормі), стероїдів, пігменту уробіліну, що забарвлює сечу в жовтий колір та інших речовин.
До фонових екзогенних сполук відносяться продукти біотрансформації речовин, що надійшли з їжею, та різних лікарських речовин, що використовуються наркоманами для посилення наркотичного ефекту, зняття синдрому абстиненції, пом'якшення “виходу” зі стану наркотичного сп'яніння (барбітурати, похідні 1,4-бензодіазепіну), а також метаболіти інших хімічних речовин, що потрапили в організм (барвники, антиоксиданти, продукти тютюнопаління тощо).
Пробопідготовка сечі може складатися з різних операцій: пряме концентрування (упарювання деякої кількості сечі до невеликого об'єму на водяній бані або роторному випарнику), екстракція розчинниками, ліофілізація, хроматографічне поділ або сорбція на твердому сорбенті або комбінація різних операцій (концентрування – екстракція та ін.).
Обробці екстракцією може бути піддана цільна кров, плазма або сироватка. Якщо для запобігання згортанню крові використовувалися антикоагулянти, необхідно враховувати, що гепарин витісняє жирні кислоти з місць їх зв'язування з альбуміном. Це впливає, з одного боку, збільшення зв'язування токсичних речовин з білками, з іншого – на перехід жирних кислот в органічний розчинник при екстракції. Для зменшення ензиматичної активності кров рекомендується зберігати у холодильнику в замороженому вигляді. Оскільки скляні стінки посуду містять велику кількість вільних гідроксильних груп, можливе зв'язування полярних токсичних сполук стінками посуду за рахунок утворення водневого зв'язку.Це особливо важливо враховувати при аналізі слідових кількостей речовини. Попереднє силилювання стінок посуду дозволяє звести це явище до мінімуму. Альтернативою є використання посуду з поліпропілену або тефлону, хоча при цьому необхідно зважати на забруднення проби мономерами смоли.
З ендогенних сполук крім жирних кислот в екстрактах із крові зустрічаються різні стероїдні гормони (тестостерон та ін.), холестерин, які у крові перебувають у зв'язаному стані з протеїнами плазми. При зберіганні крові більше доби за кімнатної температури відбувається новоутворення алкоголю, досягаючи концентрації 1 ‰.
Слина є продуктом секреції залоз порожнини рота. Відібрану пробу центрифугують і для зберігання заморожують, щоб уповільнити активність ферментів. Зберігати краще слину в склянках з тефлону або поліпропілену, щоб уникнути поглинання слідових кількостей аналізованої речовини стінками скляного посуду. Встановлено, що неіонізовані форми токсичної речовини, що знаходяться у водному розчині плазми, пасивно дифундують у слину, тому існує пряма залежність між концентрацією аналізованої речовини в слині та її концентрацією в крові.
Волосся становить відносно гомогенний (з точки зору агрегатного стану) біологічний субстрат. Як легкодоступний для відбору, вони становлять значний інтерес як об'єкт при проведенні хіміко-токсикологічного аналізу як на неорганічні, так і на органічні речовини. При аналізі волосся наркотики можуть бути виявлені у віддалені терміни після закінчення їх прийому та в тих випадках, коли аналіз біорідин дає негативний результат. Використання волосся як об'єкт дослідження дозволяє простежити динамікунадходження наркотичної речовини до організму людини. Аналіз волосся довжиною 6-8 см (6-8 місяців) дозволяє судити про рівень наркотичної залежності.
У порівнянні з біорідинами, дослідження твердих шкірних утворень має низку відмінних рис, які накладають відбиток на всі етапи проведення робіт. Дослідження волосся включає дві принципово важливі з погляду інтерпретації результатів стадії: попереднє дослідження поверхні волосся на присутність аналізованих речовин і проведення очищення зазначеної поверхні від заважають подальшому дослідженню речовин з обов'язковою перевіркою ефективності даної операції. До основних методів руйнування волосся належать такі: екстракція органічними розчинниками; кислотний або лужний гідроліз; ензиматичне руйнування; екстракція органічними розчинниками за надкритичних умов; термічне розкладання об'єктів.
Жовч є продуктом секреторної діяльності печінки, жовчного міхура та дванадцятипалої кишки. Ця рідина містить велику кількість води, ендогенних речовин, подібних до тих, що знаходяться в крові, плазмі та сироватці, а також жовчні кислоти і пігменти. Жовч відрізняється за величиною рН (не більше 6,7-8,3), що змушує контролювати рН під час підготовки до екстракції, а за необхідності використовувати відповідний буфер. Рекомендується також пробу центрифугувати при низьких швидкостях (для видалення холестерину) і осадити білки додаванням суміші хлороформ – метанол (2:1) або хлороформ – ізопропанол (9:2).
Печінка є центральним органом хімічного гомеостазу. У печінці знаходиться велика різноманітність екзогенних та ендогенних речовин: продукти білкового, вуглеводного, жирового обмінів, продукти біотрансформаціїекзогенних, зокрема токсичних речовин. З точки зору присутності ендогенних та екзогенних речовин в екстракті з печінки цей об'єкт є найнезручнішим внаслідок їх великої різноманітності. Навіть найтриваліша та багатоетапна екстракція, наприклад, кислих лікарських засобів дає у хлороформному екстракті до восьми різноманітних ендогенних сполук.