946-АДРЕНОРЕЦЕПТОРИ ЯК РЕГУЛЯТОРИ ВНУТРІНІКЛІТИЧНОГО КАЛЬЦІЮ В АДИПОЦИТАХ БІЛОГО ЖИРУ -
Симпатична нервова система та нейротрансмітер норадреналін (НА) відіграють важливу роль у процесі ліполізу тригліцеридів білої жирової тканини [1]. Взаємодія норадреналіну з β-адренорецепторами призводить до активації Gs-білків, аденілатциклази, збільшення рівня сАМР та активації протеїнкінази А (PKA). Фосфорилювання протеїнкіназою А гормон-чутливої ліпази та периліпіну ініціює ліполіз [5]. На клітинах бурого жиру показано, що активація β-адренорецепторів може спричиняти зростання не лише САМР, а й Са 2+ [4]. Механізми β-адренорецепторів залежного підвищення [Ca 2+ ]i в адипоцитах білої жирової тканини невідомі. У цій роботі на первинній культурі білих адипоцитів мишей передбачалося встановити участь β-адренорецепторів та їх підтипів у формуванні Са 2+ -сигналу, шляхи передачі цих сигналів, участь Са 2 + каналів ендоплазматичного ретикулуму.
Матеріали та методи дослідження
В експериментах використовували первинну культуру білих адипоцитів миші на 9 день культивування (9 DIV), отриману з мезенхімальної фракції стовбурових клітин епідидимального жирового депо відповідно до загальноприйнятої методики [8]. Вимірювання динаміки цитозольного кальцію ([Ca 2+ ]i) проводили за допомогою системи аналізу зображень "Cell observer" (Carl Zeiss, Німеччина) на базі моторизованого мікроскопа Axiovert 200M з високошвидкісною чорно-білою CCD-камерою AxioCam HSm. Джерелом світла служила ртутна лампа НВО 100. Порушення флуоресценції Fura-2 проводили при двох довжинах хвиль (340 і 387 нм) з використанням замикаючих світлофільтрів BP 340/30 і BP 387/15, реєстрація в області (465-м55 ВР 510/90). Для формування зображення використали об'єктив Plan Neofluar 20×/0.3. В експерименті отримували серії зображень культури зінтервалом 3 сек. Для обробки серій зображень використовували програму Image J 1.44). Клітини завантажували кальцій-чутливим зондом Fura-2 (Molecular probes, USA) у збалансованому сольовому розчині Хенкса (HBSS), що містить 10 мМ HEPES, pH 7,4 при 37 °С протягом 40 хв з наступним відмиванням від барвника протягом 15 хв. . Побудову графіків здійснювали за допомогою програми Origin-8. Результати, представлені у роботі, отримані на 4-х клітинних культурах з 5-ма повторами кожної культури.
Результати дослідження та їх обговорення
Раніше нами було показано на культурі білих адипоцитів, що норадреналін (НА) у фізіологічних концентраціях викликає 3 типи кальцієвих відповідей у білих адипоцитів. Оскільки НА взаємодіє з ? . Як випливає з малюнка, Са2+ -відповідь починається після лаг-періоду і є повільним збільшенням цитозольного кальцію.
Подібні Са 2 + -відповіді були зареєстровані під дією ізопротеренолу (агоніст β1, β2, β3-адренорецепторів), та BRL (агоніст β3-адренорецепторів) (рис. 2). Максимальна амплітуда збільшення [Ca2+]i спостерігалася при аплікації агоніста β3-адренорецепторів, що узгоджується з даними про те, що β3-адренорецептори селективно експресовані у зрілих адипоцитах [7]. Слід зазначити, що зміни [Ca2+]i під дією кожного з трьох агоністів зазвичай розвивається повільна двофазна відповідь.
Мал. 1. Зміна [Ca2 + ]i в адипоцитах білого жиру при активації β-адренорецепторів норадреналіном (НА) на фоні антагоніста β1,2-адренорецепторів – фентоламіну
Мал. 2. Збільшення [Ca2 + ]i у диференційованих білих адипоцитах при активації β-адренорецепторів та протеїнкінази А. Активація β-адренорецепторів селективними агоністами – ізопротеренол (?1,2,3, крива 1), BRL-37344 (?3, крива ), аденілатциклази (форсколін, крива 3) та протеїнкінази А (8-Bromo-cAMP, крива 4) ? призводить до повільного збільшення [Ca2+]i
Для доказу специфічності Ca2+-відповіді були використані селективні інгібітори β-адренорецепторів пропраналолу та α1-, α2-адренорецепторів фентоламін. Як випливає з табл. 1, пропраналол повністю пригнічував Са2+ -відповідь під дією ізопротеренолу, а фентоламін не впливав на цю відповідь.
Для визначення джерела збільшення Са2+ було проведено експерименти з інгібіторами різних Са2+-транспортуючих систем (каналів). У табл. 1 показано, що у присутності ксестоспонгіна (інгібітора IP3-рецепторів) відбувається пригнічення амплітуди Са2+-відповіді на 84%. Таким чином, підвищення Са2+ є наслідком активації рецепторів IP3. Відомо, що для цілого ряду незбудливих клітин мобілізація Са2+ є IP3-і Са2+-залежною, а активність IP3R регулюється фосфорилуванням різними протеїнкіназ.
Зміна [Са2+]i під дією 3 µM ізопротеренолу та антагоністів рецепторів