Аптамери для діагностики раку
Знайдуть та знешкодять
Наталія Булгакова, «Пошук» №21-2015
Аптамери – синтетичні одноланцюгові молекули РНК чи ДНК, здатні зв'язуватися з бажаними мішенями. Інакше кажучи, одноланцюжкова молекула ДНК утворює тривимірну структуру, що нагадує кільце з «хвістами» різної довжини, що відходять від нього. Ось ними вона і «зв'язується» з ділянками молекули того чи іншого білка. Від послідовності утворюють молекулу ДНК олігонуклеотидів залежить конформація (геометричні форми, які можуть набувати молекули) аптамера, а отже, і його спорідненість до мішені (тобто сила зв'язування з молекулою обраного дослідником білка). Підібравши потрібну послідовність із великої бібліотеки аптамерів, вчені отримують ті, що їм потрібні, наприклад, ті, що зв'язуються з клітинами злоякісних пухлин. Селекція – справа, прямо скажемо, не з легких: адже така бібліотека включає 10-12-ю мірою різних послідовностей (видів аптамерів), а для вирішення поставленого завдання підходять лише одиниці. Аптамери називають «цифровими ліками»: на їх основі можна виготовляти діагностичні та терапевтичні препарати. За кордоном дослідження в цій галузі почалися наприкінці 1990-х років, і вони вважаються дуже перспективними.
– Як ви відбираєте потрібну послідовність?
– Якщо ми підбираємо аптамери до пухлинної тканини, спочатку беремо клітини крові здорової людини та здорову тканину. Ми не хочемо, щоби аптамери з ними зв'язувалися. Інкубуємо з цими клітинами бібліотеку аптамерів. Ті аптамери, що зв'язалися зі здоровими клітинами, нам не потрібні, і ми їх відокремлюємо. Аптамери, що залишилися, інкубуємо з клітинами раку. Забираємо аптамери, що не зв'язалися, а ті, що зв'язалися, залишаємо. Збільшуємо кількість їх ампліфікованих копій. При ампліфікаціїолігонуклеотидів з'являються випадкові зміни в послідовності, необхідні здійснення спрямованої «еволюції в пробірці».
Робимо кілька таких раундів, йдемо разів 10-15 цим колом. І далі перевіряємо, в якому раунді у нас вийшли аптамери, які найкраще пов'язуються з бажаними мішенями – раковими клітинами – і не зв'язуються з іншими клітинами. Можна аналогічно перевірити отримані аптамери клітин інших видів пухлини. Чим суворіша негативна селекція, тим краще виходять аптамери.
Далі проводимо секвенування, дізнаємося про послідовність нуклеотидів у всіх аптамерах, присутніх у цьому пулі. Раніше використовували простіший метод клонування, картина була не зовсім повною. Зараз ми робимо повногеномне секвенування та отримуємо абсолютно всі послідовності. Вибираємо методами біоінформатики цілі сімейства аптамерів, та якщо їх зустрічаються частіше: отже, краще зв'язуються з клітинами мішені.
У ході проектів, підтриманих грантами ФЦП «Дослідження та розробки» у минулі роки, в лабораторії було отримано аптамери до тканин раку легкої людини, які дозволяють ідентифікувати клітини та продукти розпаду пухлини у клінічних зразках. Якщо аптамерами пофарбувати пухлинну тканину, під мікроскопом добре помітні скупчення ракових клітин та здорові ділянки.
Про виникнення онкозахворювання можна будувати висновки про появу у крові онкомаркерів – білків, притаманних тієї чи іншої ракового захворювання. Однак наявність пухлини неможливо визначити лише по одному білку. Та й концентрація дуже багатьох відомих біомаркерів у крові різних пацієнтів навіть з тим самим діагнозом сильно варіює. У одного страждаючого на ракове захворювання ця концентрація дуже висока, у іншого –низька, але це не означає, що він не має раку! І хворобу можна згаяти. Тому зараз вчені дійшли того, що для більш точної діагностики потрібний комплекс різних біомаркерів – сигнатура. Однак не всі онкомаркери, що застосовуються зараз, мають достатню специфічність, тобто у них відсутня сувора вибірковість по відношенню до мішеней, з якими вони зв'язуються. Мультиплексна система з використанням шести аптамерів, отриманих до пухлинної тканини, дозволить діагностувати рак точніше.
Принцип роботи електрохімічного біосенсора для діагностики онкозахворювань на основі ДНК-аптамерів
Оскільки робота проводиться у тісній співпраці з лікарями-онкологами Красноярського крайового онкологічного диспансеру ім. А.І.Крижановського, вчені точно знають, який результат потрібен для використання у клінічній практиці.
До третього етапу проекту, на якому чекає секвенування та синтез аптамерів, мультиплексний сенсор, як очікується, вже буде готовий, і можна буде проводити його випробування.
Як тільки буде готовий та сертифікований прилад, створено набори реактивів, онкодиспансер готовий одразу розпочати впровадження. Чекають із нетерпінням! Прилад виготовлятиме КБ «Іскра», що спеціалізується на розробці супутникового зв'язку. Вже готують чисті кімнати, необхідні для виробництва.