Дослідження мікрофлори поверхні риби
До поверхні досліджуваної риби прикладають предметне профламбоване скло і притискають його протягом 1 хв. Скло обережно знімають, підсушують, готують фіксований препарат та фарбують за методом Грама. Готовий мазок проглядають під мікроскопом з імерсійним об'єктивом у тридцяти полях зору.
Дослідження мікрофлори внутрішніх тканин риби
У тілі риби стерильним скальпелем роблять надріз, обережно вводять до нього предметне скло. З одного боку скло витирають фільтрувальним папером, мазок з іншого боку скла сушать, фіксують, фарбують за Грамом. Препарат проглядають у тридцяти полях зору під мікроскопом з імерсійним об'єктивом.
З глибини м'язів також беруть відбиток. Для цього шкіру посередині спини риби звільняють від луски та припікають розжареним скальпелем. Стерильними ножицями та пінцетом вирізують шматочок м'яса на глибині 1–1,5 см загальною площею 2 см2. Вирізаним шматочком роблять кілька відбитків. На предметне скло шматочок прикладають різними гранями на 1 хв. Препарат сушать, фіксують, забарвлюють за методом Грама та переглядають під мікроскопом з імерсійним об'єктивом у тридцяти полях зору.
З кожної проби риби необхідно приготувати щонайменше два мазки-відбитки.
Результати мікроскопування оцінюють відповідно до даних, наведених у табл. 12.
Таблиця 12 -Оцінка результатів бактеріоскопічного аналізу риби
Відсутні мікробні клітини або поодинокі коки і дріжджі (до 10 клітин); слідів розпаду м'язової тканини немає
З частково зміненою свіжістю
Не більше 30 коків, дріжджів або паличкоподібних клітин; помітні сліди розпаду м'язової тканини (ядра м'язових волокон у стані розпаду, смугастість м'язових волокон слабопомітна)
Більше 30 мікробних клітин з переважанням паличкоподібних форм; спостерігається значний розпад м'язової тканини, майже повне зникнення ядер та смугастість м'язових волокон
Бактеріологічне дослідження Бактеріологічний метод полягає у виділенні та ідентифікації чистої культури збудника (популяції).
При бактеріологічному дослідженні кожну пробу звільняють від жирової та сполучної тканин, занурюють у спирт, потім вирізують стерильними ножицями з глибини різних місць шматочки 2,0×1,5×2,5 см. Усі вирізані шматочки подрібнюють стерильними ножицями. Для сівби становлять середні проби по 15 г.
Визначення загальної кількості мікробів (кмафАнМ)
Загальна кількість мікробів – це кількість мезофільних аеробних та факультативно-анаеробних мікроорганізмів (КМАФАнМ) в 1 г (см 3) продукту. Метод визначення КМАФАнМ заснований на здатності мезофільних аеробних і факультативно-анаеробних мікроорганізмів розмножуватися на щільному живильному агарі при температурі 30 ± 1 °С протягом 72 год. Кількість продукту, що засівається, встановлюють з урахуванням найбільш ймовірного мікробного обсіменіння. При дослідженні свіжої риби в живильне середовище засівають розведення від 10-1 до 10-4.
Для посіву 0,1 г продукту (розведення 10 -1 ) готують перше десятикратне розведення суспензії: стерильною піпеткою набирають 1 см 3 суспензії, переносять її в пробірку з 9 см 3 стерильного фізіологічного розчину (1 см 3 отриманого розчину містить 0,1 г продукту ).
Для посіву 0,01 г продукту (розведення 10 -2 ) готують друге десятикратне розведення: стерильною піпеткою перемішують вміст пробірки з першим розведенням, набирають 1 см 3 і переносять у пробірку з 9 см 3 стерильного фізіологічного розчину (1 см 3 отриманого розчинумістить 0,01 г продукту).
Для посіву 0,001 г продукту (розведення 10 -3 ) готують третє десятикратне розведення: стерильною піпеткою перемішують вміст пробірки з другим розведенням, набирають 1 см 3 і переносять в пробірку з 9 см 3 стерильного фізіологічного розчину (1 см 3 одержаного розчину ).
Для посіву 0,0001 г продукту (розведення 10 -4 ) готують четверте десятикратне розведення: стерильною піпеткою перемішують вміст пробірки з третім розведенням, набирають 1 см 3 і переносять у пробірку з 9 см 3 стерильного фізіологічного розчину (1 см 3 отриманого розчину 0001 г продукту).
У чашки Петрі із заздалегідь маркованою кришкою засівають по 1 см 3 кожного розведення і заливають 10-15 см 3 розплавленим і остудженим до 40-45 ° С м'ясопептонним агаром (МПА). Відразу після заливання агару вміст чашок Петрі ретельно перемішують шляхом легкого похитування для рівномірного розподілу посівного матеріалу. Після застигання агару чашки Петрі перевертають кришками вниз і ставлять на 72 год термостат при температурі 30 °С.
Після закінчення культивування підраховують кількість колоній, які виросли на чашках з МПА. При цьому використовується лупа із збільшенням у 4–10 разів або спеціальний прилад для підрахунку колоній. При великій кількості колоній та їх рівномірному розподілі в агарі на дно чашки Петрі наносять чотири або більше однакових секторів, підраховують число колоній у двох-трьох секторах (але не менше ніж на 1/3 поверхні чашки), знаходять середнє арифметичне число колоній та множать на загальна кількість секторів усієї чашки.
Кількість мезофільних аеробних та факультативно анаеробних мікроорганізмів в 1 см 3 свіжої риби (X) обчислюють за формулою
деn- кількість колоній,підрахованих на чашці Петрі;
m– число десятикратних розлучень.
За остаточний результат приймають середнє арифметичне підрахунку двох чашок із різними розведеннями продукту.