Фарби та їх приготування

Всі фарби, що вживаються в гістології, за спорідненістю їх до тих чи інших тканинних елементів діляться на ядерні (основні) і дифузні (кислі). Кожна група налічує значну кількість засобів для фарбування. В умовах роботи патологогістологічного відділення немає потреби у всій масі фарб. Для переважної частини діагностичних досліджень достатні такі прості способи забарвлення, як гематоксилін-еозин і Ван-Гизону, і кілька спеціальних методів (фосфорно-вольфрамовий гематоксилін, судан-III, конго-рот і т. д).

Основні, або ядерні фарби.

У цій групі найбільше значення мають барвники, виготовлені з гематоксиліну.

Гематоксилін є екстрактом кампешового дерева, має вигляд бурого кристалічного порошку, добре розчинного у спирті та погано у воді. Існує багато способів приготування гематоксиліну, але суть їх одна – його окиснення.

Фарбувальною речовиною є не сам гематоксилін, а продукт його окиснення гематеїн (C16H1406). У зв'язку з цим частина гематоксилінових фарб придатна для роботи не відразу після приготування, а тільки через деякий час, протягом якого відбувається окислення гематоксиліну в гетеїн, що позначається як «дозрівання фарби». У міру дозрівання фарби зростає її здатність, що барвить. Дозрівання вимагають лише ті гематоксилінові фарби, які готують без окислювачів.

З квасцових гематоксилінів, що готуються з окислювачами і тому відразу фарбують, використовується гематоксилін Караци та залізний гематоксилін Вейгерта.

Гематоксилін Караци має наступний склад:

Вода дистильована – 400мл

Гальба алюмо-калієва – 25 г

Гематоксилін кристалічний – 0,5 г

Гліцерин – 100 мл

Йоднуватокислийкалій – 0,03 г

Суміш готують за кімнатної температури. Спочатку вона є світло-фіолетовою прозорою рідиною, яка через кілька годин стає темно-вишневою і непрозорою; з цього моменту вона починає фарбувати зрізи, необхідний час фарбування – 20-40 хвилин. У наступні дні барвник наростає через 1-2 тижні хороші результати будуть вже через 10-15 хвилин. Надалі, у міру дозрівання, барвник може перефарбовувати.

Фарбувальний розчин має велику стійкість, зберігається близько 10 років; у перші тижні після приготування можна не фільтрувати. Для попередження плісняви до фарби додають кілька кристаликів тимолу.

Залізний гематоксилін Вейгерта (Ван-Гізон) готують із двох основних розчинів (Вейгерт 1 і Вейгерт 2) тільки при необхідності.

Розчин Вейгерт 1 є 1% розчин гематоксиліну в 960 спирті (на 100 мл 1 г).

Розчин Вейгерт 2 має наступний склад: 4 мл міцної хлористоводневої кислоти і додають 95 мл дистильованої води.

Цей розчин бажано готувати терміном трохи більше 3-4 місяців.

Перед вживанням змішують точно порівну обидва розчини в маленькому градуйованому циліндрі; виходить густа темно-фіолетова суміш. Свіжоприготовлена суміш має високу фарбуючу здатність, інтенсивно забарвлює зрізи протягом 3-5 хвилин. Правильно приготований розчин залізного гематоксиліну має відрізнятися відомою стійкістю і не змінювати кольори близько 40-60 хвилин. У наступні години така фарба стає темно-вишневою з коричневим відтінком, а з 2-3-го дня поступово буріє, зберігаючи цей колір кілька тижнів. Найкраще користуватися сумішшю відразу після приготування, проте якщо вона була добре приготовлена, то,незважаючи на буріння, її з великим успіхом можна використовувати повторно, не вдаючись до фільтрування ще 1-2 тижні.

Фарба, в якій з'явився осад, непридатна для повторного вживання.

Якщо свіжоприготовлена фарба починає буріти і набувати зеленого відтінку відразу або незабаром після приготування (протягом 5-10-20 хвилин), то вона вважається непридатною, бо наводить надалі і бурого і зеленого забарвлення ядер, у той час як нормально вони повинні бути чорними . Таке передчасне побуріння та позеленіння фарби зазвичай пов'язане з переважанням суміші другого розчину (Вейгерт 2).

Слід пам'ятати, що при змішуванні краплями таких розчинів, як Вейгерт 1 і 2, для отримання рівних об'ємних відносин необхідно брати першого розчину в 2 рази більше крапель, ніж другого. Наприклад, на 2 краплі другого потрібно взяти 5 крапель першого розчину. Це пояснюється різницею поверхневих натягу цих розчинів (один – спиртовий, інший – водний), внаслідок чого краплі їх неоднакові за обсягом. Зрозуміло, що піпетки для них мають бути однаковими. Можна скористатися і однією піпеткою, але тоді, перед тим як набирати фарбу, піпетку щоразу потрібно ретельно промивати в дистильованій воді.

Всі гематоксилінові барвники забарвлюють ядра в темно-синій (квацевий) або чорний (залізний гематоксилін) колір.

Кислі фарби. З дифузних фарб постійне застосування мають еозин, кислий фуксин та пікринова кислота. Останні дві фарби використовують у спеціальній суміші друг з одним, званої пикрофуксином чи сумішшю Ван-Гизона.

Еозин – синтетичний барвник, тетерабрампохідне флуоресціну.

Виділяється у вигляді натрієвої, калієвої або амонієвої солі. Розрізняють багато сортів еозину, їх найбільшепоширення мають: еозин жовтий (розчинний введення), блакитний (розчинний у спирті), еритрозин (розчинний тільки у спирті). Використовуються еозини у 0,25-0,5% водних чи спиртових розчинах. Для приготування спиртових розчинів можна користуватися будь-якими сортами еозину та брати спирт різної міцності (від 40 ° до 70 °); вони забарвлюють сильніше за водні. Іноді користуються розчинами еозину, підкисленими оцтовою кислотою, приблизно з розрахунку 1 крапля міцної оцтової кислоти на 100 л розчину еозину. Підкислювати краще спиртові розчини еозину, тому що водні (підкислені) з часом можуть каламутніти і давати опади. Такі підкислені розчини показані у тому випадку, коли тканини погано сприймають звичайний (непідкислений) барвник.

Розчини еозину рожевого кольору, в такий же колір вони фарбують тканини. Терміни фарбування дуже різні (від 5-10 секунд до 3-5 хвилин) і залежать від сорту, способу приготування та відсоткового вмісту барвника.

Пікрофуксин. Готують з насиченого при кімнатній температурі водного розчину пікринової кислоти і 1% водного розчину кислого (не основного) фуксину (при кімнатній температурі 100 мл дистильованої води розчиняється близько 12 г пікринової кислоти).

Обидва розчини змішують із розрахунку 10 мл пікринової кислоти на 1 мл фуксину. Виходить рідина гранатового кольору. Особливістю цієї суміші є те, що різні тканини вона забарвлює по-різному і цим значно полегшує їх дослідження. Кожна тканина сприймає з цієї суміші тільки одну складову частину фарби і саме ту, яка має найбільшу спорідненість до неї. Так, сполучна тканина найкраще сприймає кислий фуксин і тому забарвлюється яскраво-червоний колір. М'язова тканина (поперечносмугаста та гладка), еластичні волокнафарбуються пікриновою кислотою в жовтий колір та цитоплазма різних клітин. Ця обставина має дуже важливе диференціально-діагностичне значення, і в цьому велика перевага пікрофуксину перед еозином, що однаково зафарбовує всі тканини.

Пікрофуксин потребує ретельного приготування. Крім точного дотримання співвідношень зазначених компонентів, фарбу іноді доводиться підганяти за контрольними препаратами, додаючи до неї то одну, то іншу складову частину. Так, якщо переважає фуксин, то доливають пікринову кислоту і навпаки. Правильно приготовлена фарба відрізняється тим, що її складові дають на тканинах, до яких вони мають невелику спорідненість, лише свій абсолютно чистий тон і не забивають один одного.

Всі фарби для гістологічних робіт обов'язково готують на дистильованій воді.

Способи забарвлень

У гістологічній техніці залежно від кількості фарбуючих засобів розрізняють такі види забарвлень:

- Просту (застосовується одна фарба),

- подвійну (дві фарби)

- Потрійну, або складну (три фарби).

У всіх цих забарвленнях головна роль належить ядерній (основній) фарбі, яка використовується або одна, або в поєднанні з кислими (одною або декількома).

Найбільш поширені комбіновані забарвлення, тут можливі різноманітні поєднання. У патологогістологічній практиці широко застосовуються гематоксилін у комбінації з еозином (подвійна) та гематоксилін з пікрофуксином (потрійна). Останнє забарвлення відоме під ім'ям Ван-Гізона.

Фарбування препаратів в обох випадках йде за однією і тією ж схемою і полягає у послідовному застосуванні спочатку ядерної, а потім кислої фарби з промиванням у воді після кожної з них.

Також існують іінші типи фарбування:

Прогресивне фарбування - спосіб, при якому зрізи знаходяться в фарбнику до тих пір, поки не досягнуть необхідного рівня фарбування.

Регресивне - зрізи спочатку перефарбовують, а потім доводять до необхідного забарвлення шляхом відмивання у відповідній рідині, що дозволяє виразніше виділити окремі елементи тканин.

Слід пам'ятати:

а) про ретельне видалення рідини, що відмиває (інакше вона продовжуватиме діяти і спотворить результат забарвлення);

б) про краще застосування тонких зрізів;

в) про те, що розведені барвники дають кращі результати, ніж міцні розчини (товсті зрізи та висока концентрація барвника ускладнюють диференціювання та призводять до нерівномірного забарвлення зрізів);

г) забарвлення слід проводити під контролем мікроскопа.

Пряме фарбування – фарбування об'єкта у розчині барвника;

Непряме (протруєна) – зріз забарвлюють потрібним барвником лише після попередньої обробки спеціальними протруйними барвниками.

Усі методи гістологічного фарбування можна поділити на дві основні групи:

а) оглядові, що використовуються для отримання загального орієнтовного уявлення про об'єкт, що вивчається (забарвлюються переважно ядра і цитоплазма клітин);

б) спеціальні, які дозволяють фарбувати саме ті тканинні та клітинні елементи, які цікавлять дослідника.

Для того щоб отримати хороші результати за будь-якого методу забарвлення гістологічних препаратів, необхідно дотримуватися певних правил:

1. Фарбуючі розчини повинні бути чистими, тому будь-який барвник необхідно перед вживанням відфільтрувати, а водний розчин готувати тільки на дистильованійводі;

2. Віддавати перевагу: а) фарбування барвниками низької концентрації протягом тривалого часу перед короткочасним забарвленням барвниками високої концентрації;

б) застосування регресивних методів.

Ретельно виконувати всі процедури при підготовці зрізу до фарбування та подальшої обробки.