Генетичний аналіз ДНК, ПЛР діагностика, набори, тест-системи, генотипування, генетичний
Генетичним аналізом називають систему заходів, вкладених у вивчення механізмів генетичної детермінації ознак. Серед них чільне місце відводиться завданням формальної генетики, а саме формулювання та формалізації моделей успадкування та перевірки генетичних гіпотез на конкретному емпіричному матеріалі. У світовій літературі цей розділ генетичного аналізу відомий під назвою segregation and linkage analysis. Саме про нього йтиметься.
Як відомо, генетика починалася з генетичного аналізу, який був надзвичайно популярним у першій половині століття, будучи основним інструментом досліджень. Потім популярність його знижується, і новий підйом інтересу до цього розділу генетики спостерігається лише останніми роками. Хоч як це парадоксально, а й втрата і нове набуття популярності генетичного аналізу викликані розвитком молекулярно-генетичних досліджень. Причина перша зрозуміла. Формальна генетика оперує абстрактним поняттям генів як дискретних чинників, лінійно розташованих у групах зчеплення і безпосередньо чи опосередковано які впливають прояв прояви. Формальна генетика не розглядає проблем, пов'язаних із структурою гена, з особливостями його функціонування, процесів, що відбуваються на шляху від гена до ознаки. Саме тому у формальній генетиці будь-яке вирішення завдання має імовірнісний, а чи не абсолютний характер. Результатом рішення є формулювання моделі успадкування ознаки та зазначення ступеня її правдоподібності. Молекулярна генетика, навпаки, дає цілком конкретні відповіді: вона дозволяє крок за кроком простежити весь шлях від гена до ознаки, з'ясувати, як зміна нуклеотидного складу будь-якої ділянки ДНК призводить до поліморфізму ознаки. Очевидно, що знання, отримані методамимолекулярної генетики більш однозначні і, отже, більш цінні, ніж результати генетичного аналізу. Саме тому у 1960–1970-ті роки поступово формується та закріплюється уявлення про те, що генетичний аналіз зжив себе і його слід розглядати як один із архаїзмів генетики.
Це твердження було б справедливим, якби не існувало широкого класу ознак, які називаються зараз комплексними (complex traits). Ці ознаки виявляються лише на рівні цілого організму, у тому контролі задіяна велика кількість генетичних і середовищних чинників, часто взаємодіючих друг з одним. До комплексних ознак відноситься переважна більшість кількісних ознак, що характеризують господарсько цінні властивості рослин і тварин, сюди відносять багато поширених спадкових хвороб людини, такі, як гіпертонія, діабет, ішемічна хвороба серця, деякі форми онкологічних захворювань, багато психічних розладів. Очевидно, що, використовуючи лише методи молекулярної генетики, не можна розібратися в природі цих ознак. Прогрес може бути досягнутий лише при поєднанні зусиль молекулярної та формальної генетики. Оскільки темпи розвитку генетичного аналізу істотно відставали від темпів розвитку молекулярної генетики, зараз генетичний аналіз є ланкою, що лімітує, на шляху прогресу генетики комплексних ознак. Саме тому останніми роками спостерігається помітне підвищення інтересу до формальної генетики: посилюється фінансування, організовуються конференції, семінари та школи. На жаль, у нашій країні поки що не відчувається великих змін, і для багатьох генетиків термін "генетичний аналіз" асоціюється з дослідженнями, що проводяться на початку століття. Щоб продемонструвати прогрес у цьому напрямі генетики, яспробувала простежити логіку розвитку генетичного аналізу, еволюцію об'єктів дослідження та припущень, у рамках яких вівся аналіз, а також вказати ті проблеми, які необхідно вирішити, щоб досягти прогресу у розумінні природи комплексних ознак.
З першого припущення випливає, що обидві батьківські форми та F1 є генетично однорідними групами, в яких усі особини абсолютно ідентичні за генами, що беруть участь у формуванні ознаки, що вивчається. Отже, нащадки всіх однотипних схрещувань між представниками цих трьох груп (P1, P2 та F1) можуть бути об'єднані без будь-якої втрати інформації. З другого припущення випливає, що всі особини з однаковим генотипом фенотипно невиразні. Отже, складність формалізованого уявлення ознаки обмежена кількістю генотипів. Саме тому об'єктом дослідження цьому етапі є бінарні ознаки.
Таким чином, у рамках зроблених припущень емпіричний матеріал може бути представлений невеликою кількістю груп великої чисельності. Завдання полягає в тому, щоб перевірити, чи емпіричні дані відповідають сформульованій моделі успадкування цієї ознаки. На першому етапі моделі успадкування максимально прості – це рецесивна чи домінантна модель. Єдиним параметром інтересу є сегрегаційна частота, визначена як ймовірність батьків із певними генотипами зробити нащадка із заданим фенотипом. Очікувана сегрегаційна частота визначається типом схрещування та моделлю успадкування. Генетичні гіпотези перевіряються одним із двох статистичних методів: або підраховуються очікувані чисельності різних фенотипічних класів і порівнюються зі спостережуваними, або оцінюється частота сегрегації і порівнюється з очікуваною.
При рецесивному контролі ознаки інформативним є схрещування двох гетерозигот. Популяційним аналогом цього схрещування є сім'ї, в яких обоє батьків здорові, а хоча б одна дитина хвора. Очевидно, що за такої умови у вибірку ніколи не потраплять ті сім'ї, де у гетерозиготних батьків суто випадково не з'явилося жодної хворої дитини. Тому отримані традиційним чином оцінки сегрегаційних частот виявляються завищеними. Для корекції цього усунення необхідно відмовитися від об'єднання нащадків аналогічних схрещувань та розглядати індивідуальні сім'ї.
Так само, як на першому етапі, тут тестуються найпростіші моделі домінантного та рецесивного контролю ознаки. Розвиток методу йде за трьома напрямками. По-перше, так само, як на першому етапі, ускладнюються моделі, але ці ускладнення, як правило, лежать у рамках моногенних діалельних моделей. По-друге, відбувається найпотужніша розробка так званої ascertainment problem – проблеми корекції усунення, викликаного невипадковістю вибору: формулюється поняття пробанда та розробляються основні принципи вирішення проблеми. І по-третє, відмова від об'єднання нащадків і потім запровадження додаткового параметра (ймовірності вибору пробанда) призводять до помітного ускладнення оцінки сегрегаційної частоти. Виникає необхідність розробки спеціальних алгоритмів отримання оцінок, розробки спеціальних таблиць та формул, адже це ще докомп'ютерна ера і всі обчислення робляться вручну.
Значно ускладнюється аналіз зчеплення. Це не гібридологічний експеримент, і фаза зчеплення генів у дигетерозиготного батька, зазвичай, невідома. При цьому зменшується інформативність даних та накладаються жорсткіші вимоги до точності аналізу. Саме в ці рокиЗ'являються дві принципово важливі для аналізу зчеплення розробки: пропонується непараметричний метод тестування зчеплення, заснований на аналізі ідентичності генів за походженням, і пропонується спеціальний критерій Lod score, завдяки якому було досягнуто величезного прогресу в локалізації генів, відповідальних за менделівські ознаки.
Проте другий етап розвитку генетичного аналізу – це аналіз простих ознак та простих моделей. Лімітуючим тут виявляється припущення про відомі генотипи батьків. Справді, лише за рецесивної чи домінантної моделі можна вибрати із популяції сім'ї, які задовольняють цій умові. Виходить замкнене коло – висловлюється припущення про модель спадкування, за її справедливості встановлюються генотипи батьків, а потім за фенотипами нащадків цих батьків тестується обрана модель.
Вихід із цієї ситуації намітився лише 1970 р., коли було знято припущення, що генотипи батьків відомі. Спочатку було запропоновано розглядати розподіл фенотипів як нащадків, а й батьків, проводячи підсумовування за всіма можливими генотипами батьків. А буквально наступного року, 1971 р., було сформульовано основи того, що зараз називається комплексним сегрегаційним аналізом. Було введено три математичні компоненти, що описують розподіл генотипів у популяції, правило передачі алелів з покоління до покоління та правило побудови фенотипу на заданому генотипі. Було показано, що в цих термінах розподілів можна записати ймовірність спільного розподілу ознак у членів родоводу. Родовід цей може мати довільну структуру, ознака може бути формалізований будь-яким способом, у тому числі бути кількісним, і моделі успадкування можуть необмежуватися простими рецесивними чи домінантними відносинами. Крім того, розподіл в окрему компоненту ймовірностей передачі генів від батьків нащадкам дозволяє ввести спеціальні критерії для перевірки менделевської сегрегації генів.
Як видно, на третьому етапі генетичний аналіз виходить за рамки обмежень, характерних для класичного генетичного аналізу, доступними для аналізу стають кількісні ознаки, моделі успадкування включають різні генетичні і середовищні фактори. Теоретично проблема аналізу комплексних ознак може вважатися вирішеною. На жаль, практично все не так просто.
Така сама ситуація спостерігається й у аналізу зчеплення. Чудово зарекомендував себе і забезпечив величезний прогрес у картуванні менделівських ознак критерій Lod score припускає, що єдиним параметром, що оцінюється, є коефіцієнт рекомбінації, а всі параметри моделі успадкування відомі. Поки є проблеми зі встановленням моделі спадкування, аналіз зчеплення також може бути переведений на автоматичний рівень. Зазвичай використовуються два методичні підходи: аналіз генів-кандидатів та сканування геному. Перший підхід передбачає, що відомі ті ключові ланки в ланцюзі біохімічних реакцій, які можуть вплинути на прояв ознаки. Тестування генів, відповідальних ці ланки, на причетність до контролю аналізованого ознаки здійснюється зазвичай непараметричними методами аналізу. Вони хороші тим, що не вимагають завдання моделі успадкування, проте їх недоліком є знижена потужність. Інший шлях - сканування геному - полягає в тому, що всі хромосоми насичуються анонімними маркерами, і передбачуваний ген, відповідальний за розвиток ознаки, "затискається" між двомасусідніми маркерами. Через невисоку інформативність даних встановити можна лише тісне зчеплення. Але для цього треба, щоб маркерів було багато, і вони щільно покривали хромосому. Проте що більше маркерів, то більше вписувалося повторних порівнянь і тим вище рівень значущості критеріїв. Можливо, що саме через ці недоліки використовуваних підходів так рідко вдається досягти успішного картування генів, відповідальних за розвиток комплексних ознак.
Зараз розвиток методів генетичного аналізу йде шляхом удосконалення аналізу зчеплення. Великі надії покладаються на багатоточкове картування та нові підходи, що поєднують параметричний та непараметричний методи, сегрегаційний та рекомбінаційний аналіз.
Таким чином, незважаючи на великий прогрес генетичного аналізу, ми ще дуже далекі від того, щоб довести аналіз комплексних ознак до автоматизму, який свого часу забезпечив прорив у картуванні та ідентифікації генів, відповідальних за розвиток менделівських ознак. На жаль, відчувається явна нестача фахівців у цій галузі, оскільки у світі налічується від сили два десятки лабораторій, де всі ці роки продовжувалися розробки методів генетичного аналізу. Наш сектор є єдиним в Україні центром, де ведуться такі дослідження.
Т.І. Аксенович, Інформаційний вісник ВОГіС, 1999 №10.