Імуноферментний аналіз

Імуноферментний аналіз(скорочено ІФА, англ. enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA) - лабораторний імунологічний метод якісного або кількісного визначення різних сполук, макромолекул, вірусів та ін., в основі якого лежить специфічна реакція антиген-антитло. Виявлення комплексу, що утворився, проводять з використанням ферменту в якості мітки для реєстрації сигналу.

Сутність та класифікація

Через різноманітність об'єктів дослідження – від низькомолекулярних сполук до вірусів та бактерій, та різноманітності умов проведення ІФА існує велика кількість варіантів цього методу.

Можлива класифікація на кшталт імунохімічної взаємодії першої стадії аналізу (у якій відбувається зв'язування визначається речовини). Якщо в системі присутні тільки аналізована сполука і відповідні центри зв'язування (антиген і специфічні антитіла), то метод єнеконкурентним. Якщо ж на першій стадії в системі одночасно присутня аналізована сполука та її аналог (мічена ферментом аналізована сполука або аналізована сполука, іммобілізована на твердій фазі), які конкурують за обмежену кількість центрів специфічного зв'язування, то метод є конкурентним .

Прикладомнеконкурентногоформату ІФА є сендвіч-метод. До носія з іммобілізованими антитілами додають розчин, що містить аналізований антиген. У процесі інкубації на першій стадії на твердій фазі утворюється комплекс антиген-антитіло. Потім носій відмивають від компонентів, що не зв'язалися, і додають мічені ферментом специфічні антитіла. Після вторинної інкубації та видалення надлишку кон'югату антитіл з ферментом визначають ферментативну активність носія, якапропорційна початковій концентрації досліджуваного антигену. На стадії виявлення специфічного імунокомплексу антиген виявляється хіба що затиснутим між молекулами іммобілізованих і мічених антитіл, що стало приводом для поширення назви «сендвіч»-метод. Ферментативна реакція (кольорова реакція) проходить у присутності перекису водню та субстрату, представленого незабарвленим з'єднанням, яке в процесі пероксидазної реакції окислюється до забарвленого продукту реакції на заключному етапі проведення дослідження. Інтенсивність фарбування залежить кількості виявлених специфічних антитіл. Результат оцінюється спектрофотометрично чи візуально.

«Сендвіч»-метод може бути використаний для аналізу тільки тих антигенів, на поверхні яких існують принаймні дві антигенні детермінанти. На цьому форматі засновано велику кількість тест-систем для імуноферментної діагностики різних інфекцій: ВІЛ-інфекція, вірусні гепатити, цитомегаловірусна, герпесна, токсоплазмова та інші інфекції.

Серед конкурентних схем твердофазного ІФА існує два основних формати:

Прямий конкурентнийформат ІФА використовує іммобілізовані на твердій фазі специфічні антитіла, а мічений ферментом і немічений антиген конкурують за зв'язок з іммобілізованим антитілом. До іммобілізованих антитіл додають розчин, що містить визначену речовину і фіксовану концентрацію міченого антигену, інкубують і після відмивання носія від компонентів, що не зв'язалися, реєструють ферментативну активність специфічних імунних комплексів, що утворилися на твердій фазі. Величина сигналу, що детектується, знаходиться у зворотній залежності від концентрації антигену. Перевагою прямої схеми єневелика кількість стадій, що дозволяє легко автоматизувати аналіз. До недоліків схеми належать складність методів синтезу ферментних кон'югатів, а також можливий вплив компонентів зразка на активність ферменту.
У непрямому конкурентному форматі ІФА використовуються мічені ферментом антитіла (специфічні або вторинні) і іммобілізований на твердій фазі кон'югат антиген-білок-носій. Непряма схема з використанням мічених антивидових антитіл є однією з найпоширеніших схем ІФА. На поверхні носія іммобілізують кон'югат антиген-білок, до якого додають розчин, що містить визначений антиген і фіксовану концентрацію немічених специфічних антитіл, інкубують і після видалення компонентів, що не зв'язалися, додають фіксовану концентрацію мічених антивидових антитіл. Після інкубації та відмивання носія детектують ферментативну активність специфічних імунних комплексів, що утворилися на твердій фазі, причому величина сигналу знаходиться у зворотно-пропорційній залежності від концентрації визначається антигену. Застосування універсального реагенту - мічених антивидових антитіл - дає можливість виявляти антитіла до різних антигенів. Крім того, аналізований зразок і мічений реагент вводяться в систему на різних стадіях, що усуває вплив різних ефекторів, що містяться у зразку, каталітичні властивості ферментної мітки. Однак така схема аналізу ускладнює його проведення через додаткові стадії.

Як будь-які імунохімічні методи аналізу, ІФА може давати хибнопозитивні та хибнонегативні результати. Наприклад, хибнопозитивні результати при визначенні антитіл до різних інфекцій можуть виникнути за рахунок ревматоїдного фактора, що єімуноглобулін M проти власних імуноглобулінів G людини; за рахунок антитіл, що утворюються при різних системних захворюваннях, порушення обміну або прийому лікарських препаратів; у новонароджених такі хибнопозитивні реакції можуть виникати за рахунок утворення в організмі дитини M-антитіл до імуноглобуліну G матері. Крім цього, причиною помилково-позитивних результатів може бути синдром поліклональної активації. При цьому, особливі речовини – суперантигени – неспецифічно стимулюють вироблення B-лімфоцитами антитіл до різних інфекцій. Практично це виявляється у неспецифічному наростанні титру антитіл відразу до багатьох збудників. Хибнонегативні результати щодо антитіл можуть бути обумовлені станами імунодефіциту, а також технічними помилками при постановці реакції.

Таким чином, за рахунок безперечних переваг імуноферментного аналізу: зручності в роботі, швидкості, об'єктивності за рахунок автоматизації обліку результатів, можливості дослідження імуноглобулінів різних класів (що важливо для ранньої діагностики захворювань та їхнього прогнозу) в даний час є одним з основних методів лабораторної діагностики.

Основні типи тест-систем в залежності від антигенів, що використовуються.

Залежно від того, які антигени використовуються, імуноферментні тест-системи поділяються на:

Лізатні – в яких використовується суміш нативних антигенів (лізований або оброблений ультразвуком збудник інфекції, одержаний у культурі);
Рекомбінантні – у яких використовуються отримані генно-інженерним способом білки-аналоги певних білкових антигенів збудника;
Пептидні — хімічно синтезовані фрагменти білків, що використовують.

Загальний напрямок розвиткуІФА-діагностикумів - це напрям від лізатних тест-систем, які прийнято називати тест-системами першого покоління, до рекомбінантних та пептидних.

Технологія отримання рекомбінантних білків дозволяє отримати у досить чистому вигляді аналог практично будь-якого окремого антигену.

Для створення високоякісної рекомбінантної тест-системи необхідно з усього антигенного різноманіття збудника вибрати антигени, які були б імуногенними (тобто, в організмі інфікованої людини повинні вироблятися антитіла до цих антигенів) і високо специфічними (тобто характерними лише для даного збудника і, можливості, що не дають перехресних реакцій з антитілами до інших антигенів).

Крім того, велике значення має якість очищення рекомбінантних білків. В ідеальному випадку можливе отримання рекомбінантної тест-системи практично зі 100% специфічністю при високій чутливості.

На практиці цього не завжди вдається досягти, проте специфічність найкращих рекомбінантних тест-систем наближається до 100%.