Як генерувати та замовляти qPCR праймери
qPCR – полімеразна ланцюгова реакція в реальному часі ефективний метод визначення експресії генів, на основі ампліфікації вихідного обсягу мРНК. Для вибору генного сектора ампліфікації потрібна пара олігонуклеотидних праймерів 3'-Front та 5'-Reverse, які позначають ділянку ампліфікації. Цей матеріал розповість як без особливого досвіду та знань створити дизайн праймерів та замовити їх синтез.
Спочатку необхідно визначити індекс транскрипта для обраного гена. У цьому прикладі ми розглянемо ген кодуючий протеїн CXCL5 так само потрібно вибрати біологічний вид, з яким ми працюємо, залежить, звідки ви витягли вашу РНК, в даному прикладі це миша CL57BL6. Тепер натисніть Go для пошуку.
І з отриманого списку важливо вибрати не сам ген, він іде першим у пошуку, а саме транскрипт.
Тепер натисніть на транскрипт в отриманому списку потрібно скопіювати Transcript ID в абсолютній більшості проектів нас цікавить протеїн кодуючий Protein coding, що не містить інтрона в цьому прикладі Transcript ID наступний: ENSMUST00000031318.5
Далі нам на підставі отриманого Transcript ID потрібно визначити нуклеотидну послідовність зробити це можна на сайті Roche LifeScience в онлайн системі Universal Probe Library.
Натисніть на Assay Design Center і почніть з вибору цільового організму. Знову ж таки в даному випадку це миша Mus musculus (Mouse). Тепер впишіть у рядок Specify your target(s) Transcript ID отриманий вище та натисніть Enter або копію Design.
Ось і результат:
CXCL5 3' tcttgggtgtgttaagagtgttct
CXCL5 5' cacagcagctttctaaaaccataa
У системі Universal Probe Library прямий праймер 3 називається leftprimer, а зворотний 5' right primer, але не суть. Власне, це готова послідовність qPCR праймерів для синтезу. Трохи нижче за сіквенс можна подивитися карту транскрипта щодо всього гена.
Якщо ви отримали попередження про відсутність інтронної сепарації в дизайні праймера, обов'язково проведіть цикл обробки ваших РНК зразків ДНКазами для повної фрагментації залишкової ДНК, так як без інтронного поділу праймери можуть ампліфікувати як cDNA так і звичайну ДНК, що може сильно вплинути на кінцевий результат. Обробляти виділений зразок РНК, ДНКазами потрібно відразу після вилучення і, зрозуміло, до синтезу cDNA або ДНКази розберуть і її.
Власне з першим етапом визначення Transcript ID можна було б особливо не морочитися, а відразу ввести цікавий для нас ген в Universal Probe Library, але тут можна припуститися помилки. Справа в тому, що Universal Probe Library пропонує різні варіанти транскриптів з куди меншим обсягом супроводжуючої інформації, замовиш помилково не кодуючий або просто не той конструкт, а потім гадатимеш, чому ампліфікація не відбувається і замість результатів, qPCR показує шум. Дрібна помилка чи неуважність, яка може коштувати місяців роботи марно.
Отже, залишилося замовити нуклеотидну послідовність. Фірм, які надають такі послуги безліч, вибір часто залежить від того, з ким у вашій лабораторії укладено контракт на обслуговування або якщо на кампусі є олігонуклеоїтідний сіквенсер. Я зазвичай замовляю через сайт Thermofisher
Все, що потрібно це вказати назву вашого гена, використовувати можна лише літери та цифри. Потім потрібно вписати назву олігонуклеатидного ланцюга та вказати нуклеатидну послідовність. Потім потрібнонатиснути Add Oligo та повторити процес для зворотного праймера. Залишилося натиснути Add to cart та перейти до оплати. Ціна за одну послідовність 5$ за умови, що використовується об'єм у 25 nmole, стандартний режим очищення та доставка в ліофілізованому вигляді, бажаєте вже готовий до використання праймер можна доплатити ще близько 5 доларів та отримати готове розведення, але RNAse free water коштує дешево та краще розводити праймери самому. До того ж ліофілізат зберігається набагато довше.
Вдалих ампліфікацій та чистих результатів.