Механізм та ферменти реплікації
Реплікація ДНК у еукаріотів
ДНК еукарит організована в нуклеосоми та знаходиться у складі хроматинових волокон. Еукаріотична ДНК також реплікується у двох напрямках, але реплікативні виделки рухаються у 10 разів повільніше, ніж у E.coli. Щоб процес реплікації йшов швидше, існує багато точок початку реплікації (кількість яких, ймовірно, перевищує тисячу). З кожної такої точки одночасно у протилежних напрямках рухаються дві реплікативні виделки (рис.9), завдяки чому реплікація цілої еукаріотичної хромосоми може завершитися навіть швидше, ніж реплікація бактеріальної хромосоми. Оскільки в еукаріотичній клітині хромосом багато, всі вони повинні одночасно реплікуватися. Таким чином, у ядрі еукаріотичної клітини працює одночасно багато тисяч реплікативних виделок.
Мал. 9 Реплікація еукаріотичної хромосоми
Розглянемо питання щодо участі ферментів у реплікації ДНК.
Фермент ДНК-полімеразу I каталізує послідовне приєднання дезоксирибонуклезідних залишків до кінця ланцюга ДНК з одночасним вивільненням неорганічного пірофосату. Рівняння реакції має вигляд:
де dNMP і dNTP означають відповідно дезоксирибонуклеозид-5 -монофосфат та дезоксирибонуклеозид-5 -трифосфат. Якщо хоча б із чотирьох попередників відсутня, то нова ДНК не утворюється, тобто. синтез нової ДНК йде лише у присутності всіх чотирьох попередників. 5 -трифосфати всіх чотирьох дезоксирибонуклеозидів не можуть бути замінені відповідними 5 -дифосфатами або 5 -монофосфатами. Фермент не працює також з рибонуклеозид-5-трифосфатами. Для роботи ДНК-полимеразе необхідні іони Mg 2+ , а її активному центрі міститься міцно пов'язані з ферментом іон Zn 2+ .
Синтез ланцюга ДНКвідбувається у напрямку 5 → 3 (рис. 10).
Мал. 10 Подовження ланцюга ДНК за допомогою ДНК-полімерази
Енергія, що витрачається на утворення кожного нового фосфодіефірного зв'язку в кістяку ДНК, забезпечується розщепленням пірофосфатного зв'язку в дезоксирибонуклеозид-5 -трифосфатах. Пірофосфат, що утворюється при цьому, руйнується потім до фосфату. ДНК-полімеразна реакція протікає тільки в тому випадку, якщо в системі вже знаходиться деяка кількість попередньої дволанцюжкової ДНК.
Корнберг та його колеги встановили, що ДНК виконує в полімеразній реакції дві найважливіші функції - вона служитьзатравкоюіматрицею.
ДНК-полімераза послідовно додає нуклеотиди до 3 -кінця одного з ланцюгів, що служить затравкою. Отже, синтез нового ланцюга відбувається у напрямку 5 → 3 . ДНК-полімераза не в змозі саам по собі без затравки почати синтез нової ДНК. Вона здатна лише подовжувати вже існуючий ланцюг, причому це може робити тільки у присутності ланцюга, що грає роль матриці.
Нуклеотиди приєднуються до ланцюга-затравки відповідно до нуклеотидної послідовності ланцюга-матриці за принципом комплементарного спарювання Уотсона-Кріка. Де б не знаходився в матричному ланцюзі залишок тиміну, в дочірньому ланцюгу в цьому місці вбудовується залишок аденіну, і навпаки. Аналогічним чином, якщо в ланцюзі-матриці стоїть залишок гуаніну, то навпроти нього в дочірньому ланцюзі буде вбудований залишок цитозину, і навпаки. Таким чином, продукт ДНК-полімеразної реакції – це дуплекс із комплементарно спареними основами. На рис. 11 схематично показано, яку роль грає в ДНК-полімеразної реакції попередня ДНК.
Мал. 11 Структура попередньої дволанцюжкової ДНК, якапотрібна для дії ДНК-полімерази. Для того щоб йшов синтез, потрібна одиночна неспарена ланцюг, яка є матрицею. Крім того, необхідно присутності ланцюга-затравки, до якого приєднуються нові нуклеотидні ланки.
Оскільки ДНК-полімеразі необхідні як ланцюг-затравка, так і вільний ланцюг-матриця, цей фермент не здатний здійснювати реплікацію цілої нативної хромосоми, якщо остання є дволанцюжковим кільцем, одноланцюжковим кільцем або інтактним лінійним дуплексом, в якому спарені усі спарені.
Нині відомо, що з реплікації необхідна як ДНК-полимераза. У цьому процесі беруть участь більше 20 різних ферментів та білків, кожен з яких виконує певну функцію. Реплікація складається з великої кількості послідовних етапів, які включають впізнавання точки початку реплікації, розплітання батьківського дуплексу, утримання його ланцюгів на достатній відстані один від одного, ініціацію синтезу нових дочірніх ланцюгів, їх елонгацію, закручування ланцюгів у спіраль та термінацію реплікації. Всі ці етапи процесу реплікації протікають із дуже високою швидкістю та винятковою точністю. Весь комплекс, що складається з більш ніж 20 реплікативних ферментів і факторів, називаютьДНК-репліказною системою,абореплісомою.
Розглянемо загалом основні етапи процесу реплікації.
Клітини E.coli містять три різні ДНК-полімерази, що позначаються I, II, III (табл. 3).
Таблиця 3 Характеристики ДНК-полімераз E.coli
В інтактних клітинах E.coli за елонгацію ланцюга ДНК відповідає головним чином ДНК-полімераза III. Вона функціонує у формі великого комплексу з молекулярною масою
550 000, званого холоферментом ДНК-полімерази III (рис. 12). Цей комплексмістить у своєму складі іон Zn 2+ і вимагає роботи наявності іонів Mg 2+ . Йому також потрібна матриця та затравка, без якої він не може ініціювати процес реплікації. Подібно до ДНК-полімерази I, він подовжує ДНК напрямку 5 → 3 , приєднуючи нові нуклеотиди до 3 -кінцю ланцюга-затравки.
Мал. 12 Холофермент ДНК-полімерази III
Обидва ферменти – ДНК-полімераза I і ДНК-полімераза III – мають три ферментативні активності. Крім полімеразної активності вони мають 5 → 3 і 3 → 5 - екзонуклеазні активності, тобто. вони можуть відщеплювати кінцеві нуклеотиди будь-якого кінця ланцюга ДНК. Функція ДНК-полімерази II поки що невідома.
Японський учений Р.Оказаки виявив, що під час реплікації ДНК E.coli та інших бактерій більшість новоутвореної ДНК виявляється у формі невеликих шматків. Ці шматки, що отримали назвуфрагментів Оказаки, містять приблизно 1000-2000 нуклеотидних залишків у прокаріотів і 150-200 нуклеотидів у еукаріотів. Оказаки припустив, що ці фрагменти є короткими відрізками молекули ДНК, що утворюються в результаті переривчастої реплікації і потім з'єднуються один з одним в один ланцюг. Завдяки цьому відкриттю вдалося показати, що один із ланцюгів ДНК реплікуєтьсябезперервноу напрямку 5 → 3 , тобто. у напрямку руху реплікативної вилки; цей ланцюг називаютьпровідною. Інший ланцюгсинтезується уривчастоз утворенням коротких фрагментів також за рахунок приєднання нових мономерів до 3 - кінця, тобто. у напрямку, протилежному до руху реплікативної вилки. Потім фрагменти Оказаки за допомогою ферментів зшиваються один з одним, утворюючи другий дочірній ланцюг, який називаєтьсявідстаючим(рис. 13).
Мал. 13 Уривчаста реплікація одного з ланцюгів ДНК
Для синтезу фрагментів Оказаки як затравки потрібні короткі відрізки РНК, комплементарні матричному ланцюгу ДНК. Ця РНК утворюється у напрямку 5 → 3 з АТФ, ГТФ, ЦТФ та УТФ за допомогою ферменту, званогопримазою. До 3 -кінця цієї короткої одноланцюгованої РНК – затравки приєднуються один за одним дезоксирибонуклеотидні залишки, комплементарні ланцюга-матриці ДНК. Зазвичай РНК-затравка складається лише з декількох рибонуклеотидних залишків, до яких потім ДНК-полімераза III приєднує 1000-2000 дезоксирибонуклеотидних залишків, і в результаті утворюється фрагмент Оказаки. Звісно, нуклеотидна послідовність новосинтезованого фрагмента Оказаки комплементарна нуклеотидної послідовності відповідної ділянки ланцюга-матриці. Після завершення синтезу фрагмента Оказаки РНК – затравка видаляється, нуклеотид за нуклеотидом, за допомогою 5 → 3 - екзонуклеазної активності ДНК-полімерази I. Новий фрагмент Оказаки приєднується до відстаючої ДНК.
Подвійна спіраль ДНК є щільно скрученою структурою. Кодуючі основи знаходяться всередині спіралі, щоб реплікуючі ДНК-ферменти змогли «прочитати» нуклеотидну послідовність матриці, ланцюги батьківської ДНК повинні бути розділені хоча б на короткій ділянці.
Розкручування подвійної спіралі та утримання двох ланцюгів на певній відстані один від одного, щоб вони могли реплікуватися, здійснюється кількома спеціальними білками (рис. 14).
Ферменти, відомі під назвою хеліказ, розплітають короткі ділянки ДНК, що безпосередньо перед реплікативною вилкою. Для розкручування ДНК потрібна енергія. На поділ кожної пари основвитрачається енергія гідролізу 2-х молекул АТФ до АДФ та фосфату. Як тільки невеликий ділянок ДНК виявляється розплетені, до кожної з ланцюгів, що розділяють, міцно приєднуються кілька молекулДНК-зв'язуючого білка(ДСБ), який перешкоджають утворенню комплементарних пар і зворотному возз'єднанню ланцюгів. Завдяки цьому нуклеотидні послідовності ланцюгів ДНК виявляються доступними для реплікативної системи. ДНК-полімераза може безпосередньо подовжувати провідний ланцюг, додаючи до її 3 -кінцю нові нуклеотиди. Інші специфічні білки допомагають примазі отримати доступ до матриці для ланцюга, що відстає. В результаті примаза отримує можливість зв'язуватися з ланцюгом, що відстає, і синтезувати РНК-затравки для фрагментів Оказаки.
Швидке розкручування ланцюгів батьківської ДНК у процесі реплікації (4500 об/хв) породжує ще одну проблему, яка полягає в тому, що за відсутності спеціального шарнірного пристрою вся хромосома, розташована попереду реплікативної вилки, повинна обертатися з такою ж швидкістю. Припускають, що уникнути цього допомагає клітині шарнір у ДНК (прямо перед реплікативною вилкою), завдяки якому обертатися з великою швидкістю доводиться лише короткій ділянці ДНК. Це може бути досягнуто за рахунок короткочасного розриву одного з ланцюгів ДНК, який дуже швидко і точно відновлюється після одного або кількох обертів. Короткочасні розриви та возз'єднання здійснюються ферментамитопоізомеразами. У прокаріотів топоізомеразу називаєтьсяДНК-гіраза.
Мал. 14 Схематичне зображення основних етапів реплікації ДНК
У міру того як реплікативна система ліквідує розриви у відстаючому ланцюгу, вона рухається вздовж ДНК, що реплікується. Два нові ланцюги з'єднуються зі своїмикомплементарними ланцюгами-матрицями автоматично, утворюючи дві дочірні спіралі, кожна з яких містить один батьківський і один новосинтезований ланцюг. Для утворення нових спіралей не потрібно ні витрат енергії, ні участі будь-якого ферменту, що «закручує».
Механізм дії ДНК-полімераз еукаріот подібний до такого у прокаріотів. Лінійність ДНК еукаріотів є причиною проблем, яких не існує у прокаріотів, що мають кільцеву ДНК. На відміну від лідируючого ланцюга, що реплікується безперервно, праймер (відрізок РНК), що знаходиться у 3 - кінця відстаючого ланцюга, руйнується і не реплікується за допомогою ДНК-полімераз. Для запобігання укорочення ланцюга на кінцях хромосоми знаходятьсятеломери- ділянки ДНК, що не реплікується. На цій ділянці ДНК може синтезуватися праймер і повнота реплікації збережеться. Теломера складається з великої кількості повторів, наприклад, у людини: ТТАГГГ. Матрицею для теломери є РНК, а спеціальний фермент теломераза, що є зворотною транскриптазу, приєднує ці фрагменти до 3 - кінця для збереження вихідних розмірів хромосоми.