Методи молекулярної діагностики хвороб картоплі
Ще два десятиліття тому методи діагностики інфекцій у рослин були досить трудомісткими і тривали багато часу. Використання рослин-індикаторів для ідентифікації вірусів, спеціальних середовищ для виявлення бактерій та інші традиційні методи аналізу займали дні, а в ряді випадків тижні та місяці.
Основний прорив стався із впровадженням у діагностику методу імуно-ферментного аналізу (ІФА), одним із найпоширеніших варіантів якого є так званий ELISA-тест (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay, ELISA). Метод дозволив як збільшити чутливість аналізу, а й скоротити час тестування до кількох годин. ELISA і по сьогодні є найбільш поширеним і широко використовуваним методом аналізу рослинного матеріалу для діагностики та ідентифікації патогенів. При постановці ІФА тестів використовується ціла низка технологій і модифікацій з використанням біотинілікованих та кон'югованих з лужною фосфатазою або пірофосфотазою антитіл у так званих прямому методі, подвійному та потрійному сандвічах та ін.
Діагностика фітопатогенів методом ІФА добре зарекомендувала себе в широкомасштабних рутинних тестуваннях рослинного матеріалу, проте метод має не завжди задовільну специфічність, діагностуючи часто не окремі патогени, а цілі групи і не дозволяє чітко ідентифікувати конкретні ізоляти та шта. Слід пам'ятати і те що, що з партії до партії якість і специфічність одержуваних антитіл може істотно різнитися. В даний час специфічність ІФА значною мірою збільшена за рахунок використання моноклональних та рекомбінантних антитіл. Використання модифікації методу ІФА - процедури імуноферментного аналізу відбитків зразків рослинних тканин нанітроцелдюлозна мембрана (tissue print-ELISA) - також забезпечує високу специфічність, хоча чутливість цього методу недостатня для використання у разі детекції ряду латентних бактеріальних інфекцій.
Дрзтим серологічним методом, що застосовується для діагностики фітопатогенів, зокрема бактерій, є метод проточної фотометрії (Alvarez, 2001), хоча висока вартість апаратури, що використовується в цій процедурі, істотно обмежує його використання в реальній практиці.
В даний час при аналізі рослинного матеріалу виникає необхідність застосування високочутливих і специфічних методів детекції, що дозволяють діагностувати патогени низької концентрації, що особливо важливо у разі контролю рослинного матеріалу на наявність карантинних патогенів. Тому на допомогу, а сьогодні все частіше на зміну традиційним і серологічним методам, у практику контролю фітосанітарного стану сільськогосподарських рослин та продуктів їх переробки приходять молекулярні технології. Це дозволяє значно підвищувати специфічність аналізів та забезпечувати чутливість, що в 10 - 100 разів перевищує чутливість ІФА.
Сучасний метод високоефективного тестування патогенів, у тому числі фітопатогенів, заснований на полімеразній ланцюговій реакції (ПЛР) (Bartlett, Stirling, 2003). Простота, високі чутливість та специфічність, хороша відтворюваність результатів аналізів швидко перетворили цей підхід на один із найбільш перспективних діагностичних методів. На відміну від традиційних та серологічних методів аналізу, що дають лише опосередковане свідчення наявності інфекції (наприклад, відомості про наявність білків-антигенів патогенів, що діагностуються), метод ПЛР безпосередньо доводить присутність збудника інфекції,специфічно виявляючи наявність конкретної послідовності нуклеїнової кислоти (ДНК або РНК) патогену, що виявляється. Крім того, метод ПЛР завдяки своїй високій чутливості дозволяє виявляти поодинокі копії геномів патогенів, виявляючи тим самим їх наявність тоді, коли іншими методами (імунологічними, бактеріологічними, мікроскопічними) це зробити практично неможливо. Особливо ефективний метод ПЛР для діагностики важко культивованих, некультивованих та приховано існуючих форм мікроорганізмів, з якими часто доводиться стикатися при латентних та хронічних інфекціях: ПЛР-технології, як правило, дозволяють уникнути складнощів, пов'язаних із вирощуванням таких мікроорганізмів у лабораторних умовах. З іншого боку, використання методу ПЛР дозволяє значно скоротити час аналізу зразка. За рахунок автоматизації процес ампліфікації займає всього 1 - 2 години, а з урахуванням попередньої пробопідготовки та реєстрації результатів аналізу весь процес займає не більше 4 годин. Крім вище перерахованого, істотним перевагою методу є можливість здійснювати кількісне визначення збудника в модифікації методу ПЛР в реальному часі.
Висока чутливість ПЛР є як перевагою, так і недоліком методу, створюючи ряд проблем, однією з яких є висока ймовірність появи хибно-позитивних і хибнонегативних даних. Крім того, коректність ПЛР-тестів, що проводяться, значною мірою залежить від адекватності методів виділення нуклеїнових кислот з рослинного матеріалу; чутливість детекції залежить від впливу присутніх у рослинному матеріалі інгібіторів ПЛР.
Все це ускладнює процедуру ПЛР-детекції, вимагаючи постановки додаткових контрольних тестів абовикористання модифікацій методу ПЛР При молекулярній діагностиці фітопатогенних грибів, вірусів і бактерій застосовують такі модифікації ПЛР: метод конкурентної ПЛР (Mauchline et al., 2002), кооперативної ПЛР (Co-PCR) (Olmos et al., 2002), ПЛР-гібридизація in situ з використанням флуоресцентних зондів (Lopez et al., 2003), мультиплексна ПЛР (Rigotti, Gugerli, 2007), метод множинної (або групової) мультиплексної ПЛР (multiplex nested RT-PCR) (Morris et al., 2001 ., 2004), метод ПЛР у реальному часі (real-time PCR) (Norman et al, 2002).
Найбільш перспективним для діагностичних лабораторій, які проводять рутинні аналізи, є методи ПЛР у форматі FLASH (FLuorescent Amplification-based Specific Hybridization) (Лаптин, 2004) або у форматі реального часу (Norman et al., 2002). Обидва формати ґрунтуються на флуоресцентній детекції продуктів ампліфікації. Обидва формати дозволяють реєструвати результати ПЛР безпосередньо під час (ПЛР у форматі реального часу) або після проведення реакції (ПЛР у форматі FLASH), без відкривання пробірок, завдяки чому вирішується проблема контамінації приміщення продуктами ПЩ', спрощуються вимоги до організації ПЛР-лабораторії, значно знижується трудомісткість та час проведення стадії детекції. Методи забезпечують також можливість простої та ефективної документації та зберігання результатів ПЛР у комп'ютерній базі даних. Слід зазначити, що ПЛР у форматі реального часу вимагає досить дорогого обладнання, тоді як вартість обладнання для ПЛР у форматі FLASH можна порівняти з обладнанням для гель-електрофорезу і в 5 - 8 разів дешевше за обладнання для ПЛР у реальному часі.
Іншим прикладом застосування молекулярних методів для діагностики фітопатогенів, заснованих на ПЛР тавключають гібридизацію, є досить перспективний, але поки що тільки метод біочіпів, що розвивається (Schultz, 1996). Переваги використання біочіпів полягають у наступному: біочіп дає можливість проведення множинного паралельного дослідження біологічних об'єктів (тисячі осередків на 1 см 2); він мініатюрний, що забезпечує зручність експлуатації, економію реактивів тощо; біочіп універсальний і дешевий, тому що одна технологічна схема забезпечує виробництво різних мікрочіпів; в біочипі можна використовувати як іммобілізовані зонди
фрагменти ДНК, РНК, білків (із збереженням ферментативних та антигенних властивостей), а також клітин – біосенсорів.
p align="justify"> Резюмуючи вищесказане, слід зазначити, що сучасні, доступні для широкого кола потенційних споживачів технології діагностики та ідентифікації фітопатогенів базуються, в основному, на двох технологіях - ІФА і ПЛР, які постійно удосконалюються в плані чутливості, надійності та простоти застосування. З іншого боку, нині існує тенденція використання комплексу методів (ring tests), які включають як традиційні (мікроскопія, виборчі середовища, патогенність тощо.), і сучасні серологічні і молекулярні тести. Діагностика фітопатогенів, як і будь-яких інших об'єктів, набуває рис динамічної і постійно еволюціонує системи.