Методи оцінки функціонування системи цитокінів, Визначення концентрацій цитокінів у
Цитокіни є локальними медіаторами, тому доцільно вимірювати їх рівні у відповідних тканинах після екстракції тканинних протеїнів з біоптатів відповідних органів або в природних рідинах: сечі, сльозовій рідині, рідині деснових кишень, бронхоальвеолярному ламові, виття чи синовіальної рідини та ін. Додаткову інформацію про стан імунної системи організму можна отримати щодо здатності клітин крові до продукції цитокінів in vitro.
Рівні вмісту цитокінів у плазмі відбивають поточний стан імунної системи та розвитку захисних реакцій in vivo. Спонтанна продукція цитокінів культурою мононуклеарів периферичної крові дає змогу оцінити стан відповідних клітин. Підвищена спонтанна продукція цитокінів свідчить, що клітини вже активовані антигеном in vivo. Індукована продукція цитокінів дозволяє оцінити потенційну здатність відповідних клітин відповідати антигенну стимуляцію. Знижена індукція цитокінів in vitro, наприклад, може бути однією з ознак імунодефіцитного стану. Тому обидва варіанти вивчення рівнів цитокінів як у циркулюючій крові, так і за їх продукції культурами клітин важливі з точки зору характеристики імунореактивності всього організму та функції окремих ланок імунної системи.
На даний момент діагностична значущість оцінки рівня цитокінів полягає в констатації самого факту підвищення або зниження їхньої концентрації у даного хворого з конкретним захворюванням. Причому для оцінки тяжкості та прогнозування перебігу захворювання доцільно визначати концентрацію як проти-, так і прозапальних цитокінів удинаміці розвитку патології[1].
Визначення концентрацій цитокінів у біологічних рідинах
Імуноферментний твердофазний аналіз
В даний час для аналізу моноклональних антитіл широко використовується метод, який називається ELISA (Enzyme-Linked immunosorbent Assay) - імуноферментний твердофазний аналіз. Це метод виявлення формування імунокомплексу - сполуки антитіла з антигеном[13].
Послідовність виконання методу [4] [Додаток 1, рис. 1] :
1. Перші моноклональні антитіла (МКАТ) попередньо іммобілізують на внутрішніх поверхнях осередків твердого планшета для ІФА[Додаток 1, рис. 2]
3. Другі МКАТ, мічені біотином, вносять по 100 мкл і інкубують зразки з ними протягом 1,5 годин при безперервному струшуванні при +18 ° С. Після інкубації розчин з осередків видаляють піпеткою. Осередки тричі промивають внесенням 300 мкл промивного розчину в кожну з них. Залишки розчину для промивання видаляють
4. Кон'югат стрептавідин-пероксидази, розведений 1:100 буфером, вносять в об'ємі 100 мкл у комірки планшета та інкубують при +18°С і безперервному струшуванні протягом години. Після інкубації розчин із осередків видаляють. За 10-15 хвилин до інкубації готують розчин тетраметилбензидину. Осередки планшета, після видалення розчину, тричі промивають внесенням 300 мкл розчину для промивання і 3-5 разів дистильованою водою з подальшим видаленням її струшуванням планшета над раковиною. В результаті даних операцій формується «сендвіч», що складається з наступних шарів: фіксоване антитіло – зразок (цитокін) – пов'язане з ферментом антитіло
5. Додають 200 мкл розчину тетраметилбензидину. Інкубують протягом 20 хвилин при кімнатній температурі у темряві. Зупиняють реакціюдодаванням 50 мкл розчину 1н сірчаної кислоти. Розщеплення субстрату ферментом призведе до зміни першого забарвлення. А щодо зміни забарвлення субстрату дізнаються про присутність цитокіну, який був у зразку. Врахування результатів, що визначають активність зв'язаної пероксидази, проводять з використанням автоматичного фотометра для мікропланшетів при довжині хвилі 492 нм, встановлюючи нульове поглинання по лунках зі стандартом без цитокіну в розчині. Кількісну оцінку результатів проводять методом побудови кривої калібрувальної, що відображає залежність оптичної щільності від концентрації антитіла. Чутливість методу під час використання вітчизняних тест-систем - 5 - 30 пг/мл[10].
Даний метод має ряд переваг:
1. високою чутливістю;
2. можливістю використовувати мінімальні обсяги досліджуваного матеріалу;
3. стабільністю при зберіганні всіх інгредієнтів, необхідні проведення ІФА (до року і більше);
4. простотою проведення реакції;
5. наявністю як інструментального (у якісному та кількісному варіанті), так і візуального обліку;
6. можливістю автоматизації всіх етапів реакції
7. щодо низькою вартістю діагностичних наборів.
Цей високочутливий метод розроблено понад 30 років тому і спочатку використовувався для визначення концентрації інсуліну та інших гормонів. Нині цей метод дуже широко використовується у лабораторній діагностиці. За допомогою РІА в біологічних рідинах визначають концентрації гормонів, факторів росту, ферментів, цитокінів, маркерів злоякісних новоутворень та інших речовин (наприклад, лікарських засобів та наркотиків).
В основі РІА лежить феномен конкуренції: зв'язування антитіл з міченим антигеном.радіоактивним ізотопом, що пригнічується в присутності неміченого антигену. Досліджуваним матеріалом зазвичай є плазма або сироватка крові, рідше інші біологічні субстрати (цереброспінальна рідина, сеча, слина і т.д.). Неміченим антигеном є шукана речовина (цитокін), мічений антиген є аналогом шуканої речовини, з'єднаний з радіоактивною міткою. Речовина, ідентична визначеному, одержують двома способами. З біологічних рідин, тканин або культур клітин шляхом очищення методами гельхроматографії, іонообмінної хроматографії, електрофорез отримують натуральні препарати. За допомогою хімічного синтезу одержують синтетичні аналоги цілих молекул визначуваної речовини або їх фрагментів, які є найбільш значущими для імунологічної реакції, тобто містять так звані антигенні детермінанти. Радіоактивний ізотоп, яким мітять антиген, в ідеалі повинен мати такі якості:
1. не змінювати імунореактивність ліганду;
2. бути стабільним;
3. мати високу питому радіоактивність.
Найбільшою мірою зазначеним вимогам відповідають ізотоп йоду 125 I, що випромінює гамма-кванти, та ізотоп водню - тритій 3 Н, що випускає бета-частинки. Радіонуклід 125 I менш стабільний у порівнянні з тритієм, у зв'язку з чим реактиви з цією міткою необхідно використовувати протягом 3-8 тижнів, проте препарати йоду більш прості для радіометрії. Антигени, мічені тритієм 3 Н, довше зберігаються (до 3-6 місяців), але мають порівняно низьку питому радіоактивність та вимагають спеціальних приладів для радіометрії – рідинних сцинтиляційних лічильників.
Загальні вимоги до сполучного реагента такі. Він повинен мати високу специфічність і високу спорідненість до зв'язуваної речовини.Специфічність визначається здатністю пов'язувати тільки аналізовану субстанцію та бути індиферентним до інших речовин, у тому числі із подібною будовою. Ступінь міцності утвореного зв'язку характеризує спорідненість сполучного реагенту до ліганду. Відомий ряд матеріалів, які здатні ефективно адсорбувати на своїй поверхні біологічні речовини. Наприклад, полістирол має високу спорідненість до більшості білків, проте утворений зв'язок носить неспецифічний характер.
Сольові, або буферні розчини, які використовуються при проведенні РІА, призначені підтримувати протягом всього дослідження оптимальний для імунологічної реакції рН системи. Найчастіше застосовуються фосфатний, боратний, барбітуратний буферні розчини та трисбуфер. Яка саме сполука використовується для забезпечення буферних властивостей, не має суттєвого значення, але рН розчину має бути в межах нейтральних значень. Допустимі коливання лише у бік збільшення - від 7,4 до 8,6, оскільки кисла реакція середовища перешкоджає утворенню комплексів [антиген-антитіло].
Методика РІА проста і включає такі основні етапи [4] [Додаток 2, рис. 1] :
1. До розчину антитіл додають мічений антиген і пробу (що містить невідому кількість неміченого антигену). Концентрацію антитіл у реакційній суміші підбирають так, щоб число місць зв'язування було набагато менше від загальної кількості антигенів. Концентрація міченого антигену має перевищувати максимальну можливу концентрацію антигену в пробі.
2. Реакційну суміш інкубують за певної температури. Мічений та немічений антигени конкурентно зв'язуються з антитілами, при цьому утворюються імунні комплекси, що містять або мічений, або немічений антиген. Таким чином, до кінця інкубації вреакційної суміші присутні мічені та немічені імунні комплекси, а також вільні мічені та немічені антигени. Кількість мічених імунних комплексів обернено пропорційно кількості неміченого антигену в пробі.
3. Щоб оцінити кількість мічених імунних комплексів, їх треба відокремити від вільного міченого антигену. Найбільш поширені два способи поділу:
а) До реакційної суміші додають речовину, що підвищує її щільність, наприклад, поліетиленгліколь.
б) До реакційної суміші додають речовину з великою молекулярною масою, яка специфічно зв'язується з антитілами у складі імунних комплексів. Для цього використовують другі антитіла або стафілококовий білок A.
В обох випадках імунні комплекси, що мають більшу молекулярну масу, ніж вільні антигени, беруть в облогу центрифугуванням і вимірюють радіоактивність осаду.
4. Визначають концентрацію антигену в пробі по калібрувальній кривій. Для її побудови використовують кілька стандартних калібрувальних розчинів із відомими концентраціями неміченого антигену.
До основних переваг радіоімунологічного аналізу належать:
1. висока чутливість - здатність визначати мінімальні кількості речовини приблизно рівні 10-14 - 10-15 моль/л;
2. специфічність - здатність системи вимірювати лише одну, суворо певну субстанцію;
3. надійність - здатність визначати справжню кількість речовини;
4. точність, яка полягає у відтворюваності одержаних результатів[10].
Недоліком методу є обмеження, що визначаються режимом роботи з радіоактивним матеріалом, та відносно короткий термін придатності діагностичного набору, що з розпадом радіоактивної мітки. Крімтого, діагностика за допомогою радіоімунного аналізу передбачає наявність спеціалізованої лабораторії, а також використання дорогого обладнання (гамма-лічильників).
Мультиплексна технологія – дуже перспективний напрямок у біології. Вона вже набула великого поширення в ПЛР-аналізі та завойовує провідні позиції у проточній цитометрії. Мультиплексний аналіз дозволяє оцінювати кілька розчинних аналітів одночасно у зразку невеликого обсягу.
У визначенні кількості цитокінів даний метод має кілька переваг:
1. Одночасний аналіз до 100 цитокінів в одному зразку
2. Багаторазове зменшення обсягу досліджуваного зразка
3. Збільшення відтворюваності результатів
4. Зниження вартості дослідження та трудовитрат[13].
В основі методу – набір стандартних процедур імуноферментного аналізу. Антитіла у разі адгезовані над планшеті, але в микрошариках[Додаток 3, рис. 1]. Частинки, покриті антитілами до різних молекул, відрізняються одна від одної за розміром (4,4 і 5,5 мкм) та інтенсивністю флуоресценції, що дозволяє легко їх ідентифікувати у суміші при аналізі на проточному цитофлуориметрі. Суміш може містити десятки видів частинок (рівні кількості досліджуваних речовин).
На першому етапі зразок інкубують з мікрочастинками та біотинільованими антитілами. Відбувається зв'язування досліджуваної речовини з відповідними антитілами пропорційно до його кількості. Потім зразок і антитіла, що не зв'язалися видаляють шляхом відмивання і додають другі антитіла, помічені флюоресцеїном. Після інкубації та відмивання зразки аналізують на проточному цитофлуориметрі. Концентрація досліджуваної речовини пропорційна інтенсивності світіння флюоресцеїну навідповідної популяції мікрокульок. Точні значення концентрацій розраховують за допомогою спеціального програмного забезпечення (що входить до складу набору) відповідно до калібрувального графіка[10].
Аналіз займає близько 4 годин, як досліджуваний матеріал використовується 200 мкл сироватки або плазми або