Набори реактивів для виявлення мутацій у генах KRAS, BRAF, EGFR, Лабораторія БіоЛінк
Призначення наборів
Набір реактивів Real-time-PCR-KRAS-7M призначений для аналізу 7 мутацій у 12 та 13 кодонах гена KRAS, що корелює з резистентністю пухлин до лікування інгібіторами EGFR.
Набір реагентів Real-time-PCR-BRAF-V600E призначений для виявлення точкової мутації GTG→GAG у 600 кодоні гена BRAF, що корелює з чутливістю пухлин до лікування інгібіторами BRAF. Також набір детектує заміну GTG на GAA, GAT та AAG. Аналіз проводиться методом аллель-специфічної ПЛР у реальному часі.
Набори реактивів призначені для виявлення точкової мутації CTG→CGG в 858 кодоні гена EGFR і мікроделецій 9-18 пар нуклеотидів гена EGFR в районі відповідному 746-750 амінокислотам білка (Real-time-PCR-EGFR-2M -21 екзонах гена EGFR (Del19, L858R, L861Q, G719A/C/S, S768I, T790M) (Real-time-PCR-EGFR-7R) корелюючих з чутливістю пухлин до лікування інгібіторами ТК-EGFR.
Набір Real-time-PCR-KRAS-7M призначений для клінічної діагностики. Реєстраційне посвідчення ФСР 2012/13492.
Характеристики наборів
Набори оптимізовані для використання з ампліфікатором ПЛР в режимі реального часу “CFX96” (Bio-Rad, США). Використання інших приладів можливе, але може вимагати зміни параметрів ПЛР та вплинути на чутливість методу.
Матеріал для дослідження
Як матеріал для аналізу використовується геномна ДНК. Мінімальна кількість ДНК, необхідна для аналізу – 2 нг. Максимальна кількість ДНК, яка може бути використана для 1 аналізу – 1000 нг.
Склад наборів
Набір містить достатні реактиви для проведення 12/36/50 реакцій із зразками ДНК та контролюми. Позитивний контроль являє собою ДНК-копії досліджуваного гена з мутацією на тлі ДНК людини без мутацій і дозволяє виявити наявність інгібіторів ПЛР, які можуть призводити до помилково-негативних результатів. Набір включає контроль без матриці (вода).
Набори складаються з пробірок з реагентами з кольоровими кришками та інструкції із застосування.
Умови зберігання
Зберігати у темряві при -18оС протягом 12 місяців.
Принцип дії наборів реактивів
Аналіз проводиться методом аллель-специфічної ПЛР як реального часу. Продукти ПЛР досліджуваного гена (KRAS/BRAF/EGFR) ідентифікуються в 5′-екзонуклеазної реакції за допомогою мідного зонда FAM. Набір містить реагенти для аналізу мутації досліджуваного гена (KRAS/BRAF/EGFR) та реагенти для внутрішнього контролю з використанням барвника ROX. Внутрішній контроль дозволяє виявити наявність інгібіторів ПЛР, які можуть призводити до помилково-негативних результатів. ПЛР суміші складаються зі всіх необхідних реагентів за винятком Taq ДНК полімерази, що поставляється в окремій пробірці. Набір також включає ДНК позитивного стандарту з мутацією у досліджуваному гені (KRAS/BRAF/EGFR) та ДНК негативного стандарту (ДНК людини без мутації).
Тест на наявність мутацій у досліджуваному гені (KRAS/BRAF/EGFR) складається з двох етапів:
Перевірка зразків ДНК у контрольній ПЛР
Контрольна реакція проводиться з метою оцінки придатності зразків ДНК для подальшого аналізу, дозволяючи вибрати оптимальну концентрацію ДНК досліджуваного гена для тесту. Причинами непридатності зразків можуть бути часткова деградація або хімічні модифікації ДНК, що виникли при фіксації тканини, які можуть інгібувати або знижуватиефективність ПЛР. Різні розведення зразків ДНК порівнюються в контрольній ПЛР з ДНК негативного стандарту, що входить до набору. Якість та кількість ДНК оцінюється за величиною Ct, яка відповідає кількості циклів ПЛР, за яких крива флуоресценції перетинає заданий рівень фону. Для цього набір містить додаткову кількість ПЛР суміші №1, що ампліфікує константний район гена, що досліджується. Для подальшої аллельспецифічної ПЛР вибирають розведення зразка ДНК, яке має найближчу величину Ct щодо негативного ДНК стандарту.
Проведення аллель-специфічної ПЛР на мутації в досліджуваному гені (KRAS/BRAF/EGFR)
На цьому етапі вибрані розведення ДНК тестують аллель-специфічної ПЛР. Для цього набір включає суміш ПЛР, що містить праймери, специфічні до виявлених мутації в досліджуваному гені. Для нормування результатів всі зразки необхідно повторно тестувати реакції з контрольною сумішшю. Також кожен експеримент необхідно включати ПЛР з позитивним стандартом і контролем без матриці. Для коректності результату усі зразки тестують у дублях. Для всіх зразків ДНК результати ПЛР для кожної мутації в досліджуваному гені (KRAS/BRAF/EGFR) представляють у вигляді різниці dCt = CtAS – CtC, де CtAS – середнє Ct зразка ДНК у ПЛР специфічної до даної мутації у досліджуваному гені (KRAS / BRAF / EGFR), CtC - середнє Ct того ж зразка ДНК у контрольній ПЛР. Потім dCt зразка порівнюють з позитивним стандартом dCt містить ДНК з кожною мутацією для досліджуваного гена (KRAS/ BRAF/ EGFR).
Зразок є позитивним (який містить мутацію), якщо dCt зразка дорівнює або менше dCt позитивного стандарту.
1 — CtC для Позитивного стандарту та невідомих зразків ДНК,
2 - CtASдля невідомого зразка ДНК #1,
3 - CtAS для Позитивного стандарту,
4 - CtAS для невідомого зразка ДНК #2.
Зразок ДНК позитивний (dCt # 1 dCtm).
Зразки ДНК без мутацій можуть давати значення CtAS більше 35.
Приклад кривих флуоресценції в контрольній (пунктирні лінії) та аллель-специфічній (суцільні лінії) ПЛР для Позитивного стандарту (червоний) та невідомих зразків ДНК (синій та зелений).
Аналіз на виявленні мутації у зразках ДНК досліджуваного гена (KRAS/BRAF/EGFR).
Завантажити каталог нашої продукції
Звязатися з нами за допомогою контактної форми: