Небезпека культивування вірусів
Однак, ймовірність того, щоДНК із постійних клітинних лінійздатна викликати пухлини у людей, вважається вкрай низькою. Навіть підшкірне введення людям великих кількостей клітин HeLa не супроводжувалося канцерогенною дією. Аналіз наявних експериментальних даних показує, що концентрація ДНК у культуральних рідинах постійних ліній клітин набагато нижча від можливих трансформуючих рівнів.
Імовірність присутності небезпечної активності на 1 молекулу ДНК становить 10 -6 -10 -19 . Особливою небезпекою можуть бути багатокопійні плазміди, ампліфіковані сильні промоторні послідовності. Білкові контамінанти з коротким терміном життя становлять менший ризик. Таким чином, прийнято вважати, що ризик, пов'язаний з домішкою гетерогенної клітинної ДНК, нікчемний, якщо її кількість не перевищує 100 пкг в одній дозі парентерально препарату. При оральному застосуванні вакцини цей ризик ще більше знижується. Агенти, які застосовуються для інактивації вірусів у вакцинах, можуть знижувати або усувати біологічну активність гетерогенної клітинної ДНК, підвищуючи тим самим їхню безпеку навіть у тих випадках, коли кількість ДНК у дозі вакцини, що вводиться парентерально, перевищує 100 пкг.
Ризик,зумовлений вірусною контамінацієюпостійних ліній клітин може бути пов'язаний з повними вірусами, механізм реплікації яких відомий, вірусними частинками, що нагадують ретро-віруси типу А, а також вірусними генами, інтегрованими в ДНК таких клітин. При використанні постійних клітинних ліній для зниження або усунення ризику вірусної контамінації слід передусім застосовувати систему посівних клітин.
Створення резервних запасівпостійних ліній клітин, перевірених відповідно до вимог ВООЗ (1982, 1987)рр.), є необхідною умовою виробництва ліцензованих вакцин. Передбачуваний ризик, пов'язаний з білками, що кодуються онкогенами постійних ліній клітин, обмежений лише факторами зростання, дія яких є транзисторною і оборотною. У концентраціях, що виявляються, вони не становлять серйозної небезпеки і, крім того, багато з них швидко руйнуються.
Методи контролю повинні гарантувативідсутність у кінцевому препараті біологічно активних кількостей потенційно онкогенних домішок (гетерогенна ДНК, білки, що трансформують, ендогенні віруси). Дослідницькі групи, що розглядали проблему приготування медичних імунобіологічних препаратів, дійшли висновку, що незважаючи на існування потенційного ризику, дані, що підтверджують безпеку препаратів, виправдовують їхнє застосування.
У 1985 р. Комітетом експертів з стандартизації біологічних препаратів були прийняті «Вимоги до безперервних ліній клітин, які використовуються у виробництві біологічних продуктів». Скасування заборони використання постійних клітинних ліній як субстрату у виробництві медичних біологічних препаратів відкрило нові можливості у справі розширення виробництва вірусних препаратів, підвищення якості і зниження вартості.
В даний часу ряді країн широко використовують постійні лінії клітин для виготовлення медичних біопрепаратів. Використання постійних ліній клітин як субстрату у виробництві вірусних вакцин має низку переваг. Вони не вимагають складних умов культивування, їх можна вирощувати у промислових культиваторах та ферментерах, добре вивчити та охарактеризувати, а маткові розплодки, вільні від контамінації ендогенними та екзогенними вірусами, довго зберігати при низькій температурі. Багатовчені вважають, що приготування вакцин з використанням клітин Vero порівняно з первинними культурами клітин нирок мавп становить менший ризик вірусної контамінації. Накопичується все більше даних, що клітини Vero та ВНК-21 – безпечні субстрати для виробництва медичних біопрепаратів.Клітини Veroне мали туморогенних властивостей, а клітини ВНК-21 (клон 13) залишалися каріологічно стабільними протягом 52 пасажів.
Вивчення чистоти табіологічної безпеки білкаклітин показало відсутність сторонніх вірусів, а також слідів вірусних послідовностей у геномі клітин Vero.
Клітини Veroвикористовують у виробництві вакцин проти поліомієліту та сказу людини. Інактивована поліовакцина покращеної якості ліцензована в 1982 р., у наступні 5 років нею щеплено понад 20 млн. дітей без побічного ефекту. У 1988 р. її виробництво становило 60 млн. доз. Інактивована вакцина проти сказу ліцензована в 1985 р. У наступний період було використано сотні тисяч доз вакцини за низького рівня клінічних реакцій. Успішно завершилися широкомасштабні клінічні випробування живої поліовакцини для орального застосування вірусу, розмноженого в клітинах Vero.
У 1987 р. у Франції ліцензованакомпонентна вакцина проти гепатиту В, що виготовляється на основі рекомбінантної лінії клітин СНТ. У Великій Британії, Японії та Китаї отримували інтерферон у культурі постійної лінії клітин Namalva.
У зв'язку з можливістюклінічного застосування моноклональних антитіл, актуальність набуває культивування таких клітин у великих масштабах. Попередні результати показують, що безперервне великомасштабне культивування гібридом у вільній суспензійній культурі у поєднанні збезперервним діалізом культурального середовища може дати хороший урожай антитіл, що секретуються (100-140 мг/л). При великомасштабному виробництві один працюючий 1000-літровий ферментер фірми Celltech може забезпечити кілограмових кількостей моноклональних антитіл. Крім того, гібридні клітинні лінії самі по собі можуть бути використані як субстрат для репродукції вірусів.
Таким чином, тількипереглядіснуючих обмежень щодо застосування тканинних культуральних систем для виробництва вірусних вакцин дозволяє використовувати індустріальні методи масового вирощування вірусів на основі суспензійного культивування - подібно до того, як це роблять у мікробіологічній промисловості. Вчених, які працюють у цій галузі, не бентежать навіть очевидні успіхи генної інженерії. Багато вчених вважають, що генна інженерія з використанням мікроорганізмів може скасувати проблеми, пов'язані з розвитком та використанням масового культивування клітин тварин, і тому технологія, яка ґрунтується на їх застосуванні, не має майбутнього. Однак у конкуренції традиційної та нової технологій виготовлення вірусних препаратів, де вирішальне значення має якість кінцевого продукту, виявились непередбачені обставини.
По-перше, при спробі експресії вірусних генів у прокаріотичних організмах не завжди отримані задовільні практичні результати. По-друге, відколи стало можливимклонувати в клітинах тварин гени, що кодують вірусні білки, важливість великомасштабного виробництва клітинних культур ще більше зросла. Ці обставини дозволили висловити сподівання, що біотехнологія клітин тварин збереже свою авангардну роль.