Основні етапи ДНК-діагностики
Основні етапи ДНК-діагностики – розділ Біологія, Генетика, спадковість, мінливість 1. Отримання Зразків ДНК (або РНК) Реалізується у двох варіантах: А).
1. Отримання зразків ДНК (або РНК) реалізується у двох варіантах:
а) виділення всієї ДНК (тотальної або геномної) з клітин:
б) накопичення певних фрагментів за допомогою ПЛР.
Джерелом геномної ДНК є будь-які клітини, що містять ядро. Виділена з клітин ДНК є весь геном організму, тому такі зразки називають геномною ДНК. Матеріалом для дослідження є периферична кров (лейкоцити), хоріон, амніотичні клітини, культура фіброб-ластів. епітелій слизової щоки, волосяні цибулини та ін. Для діагностики хвороби або гетерозиготного стану достатньо дослідити лише невеликий фрагмент геному. тому щодо аналізу необхідно отримати достатню кількість таких фрагментів, тобто.ампліфікувати(5) (помножити) їх. Накопичення необхідних фрагментів ДНК вирішується за допомогою ПЛР.
Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР)-метод ампліфікації ДНК т уйго. Протягом кількох годин можна розмножити певну послідовність ДНК у кількості, що перевищує вихідне мільйон і більше разів. Необхідною умовою для проведення ПЛР є знання нукледотидної послідовності фрагмента, що амгашфікується. Відповідно до нуклеотидної послідовності кінців досліджуваної ділянки синтезується два олігонуклеотидні прай-мери (затравки). Довжина праймерів становить 20-30 пар нуклеотидів. Процес ампліфікації здійснюється у вигляді декількох циклів, що повторюються. Кожен цикл містить три стадії: температурна денатурація ДНК. приєднання праймерів до комплементарних послідовностей одноланцюгових молекул(Відпал), синтез полінуклеотидних ланцюгів на одноланцюгових молекулах у межах приєднаних праймерів за допомогою полімерази.
2. Рестрикція ДНК на фрагменти. Цей процес здійснюється ресрикта-замі (вони відносяться до бактеріальних ендонуклеаз). Вони розривають дволанцюжкову ДНК у межах строго визначених для кожного фрагмента послідовностей нуклеотидів довжиною 4-6 пар нуклеотидів.
3. Електрофорез фрагментів ДНК забезпечує розподіл цих фрагментів при їх розподілі на поверхні агарозного або поліакриламідного гелю. Фрагменти ДНК рухаються в гелі, вміщеному в електричне поле, від негативного полюса до позитивного. Після закінчення електрофорезу кожен фрагмент ДНК займає певне положення як дискретної смуги в конкретному місці гелю. Довжину кожного фрагмента визначають шляхом порівняння пройденої фрагментом відстані з відстанню, пройденою стандартним зразком ДНК з відомими розмірами
4. Візуалізація та ідентифікація фрагментів ДНК. Після закінчення ПЛР гель обробляється етідія бромідом, що зв'язується з ДНК. при ультрафіолетовому опроміненні поверхні гелю виявляється свічення в червоній області спектру. Розроблено та інші методи фарбування ПЛР-фрагментів. Ідентифікація специфічних фрагментів ДНК здійснюється за допомогою блот-гібридизації за Саузерном. Проводять гібридизацію фрагментів ДНК (які фіксують на спеціальному фільтрі) зі специфічним нуклеотидною послідовністю міченим радіонуклідом або флюоресцентної метші олігонуклеотидним синтетичним зондом або клонованим фрагментом ДНК. Нуклеотидна послідовність зонда повинна бути повністю або частково комплементарна досліджуваної ділянки геномної ДНК. Радіоактивно мічені ділянки виявляють шляхом експонуванняфільтру з рентгенівською плівкою (ауторадіографія). Після прояву на плівці видно смуги міченої зондом ДНК. Нерадіоактивні мітки візуалізують за допомогою флюоресценції або опосередковано антитіл. Розрізняють пряму і непряму ДНК-діагностику генних спадкових хвороб.
Прямі методи можливі за умови, що ген захворювання клонований, відома його екзон інтронна організація або нуклеотидна послідовність комплементарної ДНК. Під час прямої діагностики предметом аналізу є мутація гена. Непрямі методи діагностики застосовуються, якщо ген захворювання не клонований або захворювання на генетично гетерогенне. Цей метод ґрунтується на використанні зчеплених з геном поліморфних маркерів. І тут визначається гашютип хромосоми, що несе мутантний ген у сім'ях високого ризику, тобто. у батьків хворого та його найближчих родичів. Такий підхід можливий практично для всіх генних захворювань із відомою локалізацією гена.