ОТРИМАННЯ ПРОДУКТІВ МІКРОБІЯЛЬНОГО СИНТЕЗУ

B.flavum, З . glutamicum, E. coli, Arthrobacte rparafinens, S. marcescens

Micrococcus, Candida utilis, B. subtilis

В. flavum, З . glutamicum

Розробка технологічної схеми одержання окремої амінокислоти базується на знанні шляхів та механізмів регуляції біосинтезу конкретної амінокислоти. Необхідного дисбалансу метаболізму, що забезпечує надсинтез цільового продукту, домагаються шляхом строго контрольованих змін складу та умов середовища.

Виробництво лізину.Метаболічний шлях та характеристика продуцентів.У клітинах мікроорганізмів лізин синтезується з аспарагінової кислоти і служить кінцевим продуктом розгалуженого метаболічного шляху біосинтезу, загального для трьох амінокислот – лізину , Метіоніну і треоніну (рис.8.2). У процесі утворення амінокислот із загального попередника одночасно з лізином виникають дві інші амінокислоти – метіонін та треонін. У цьому випадку ефект накопичення в середовищі всього однієї цільової амінокислоти домагаються шляхом блокування процесів, що ведуть до синтезу побічних амінокислот, що виникають у зв'язку з розгалуженням метаболічного шляху.

Фермент аспартаткиназа, що відкриває метаболічний шлях, є алостеричним білком, чутливим до інгібування за принципом зворотного зв'язку при спільній та узгодженій дії побічних продуктів L-треоніну та L-лізину.

8.2. Схема біосинтезу лізину, метіоніну та треоніну в клітинахCorynebacterium glutamicumтаBrevibacterium flavum

При накопиченні треоніну і лізину в надмірній концентрації інгібується аспартаткиназа та їх синтез зупиняється, при зниженій концентрації будь-якої з двох амінокислот процес активізується.

Щоб домогтися бразування лізину у великих кількостях, отримують мутанти двох типів. У мутантів першого типу не синтезується або не функціонує гомосериндегідрогеназ, внаслідок чого блокується синтез метіоніну та треоніну. Такі мутанти є ауксотрофами з гомосерину або треоніну (метіоніну); внутрішньоклітинна концентрація треоніну у них суттєво знижена, що знімає блокаду з аспартаткинази.

Мутанти другого типу дефектні за структурним геном, що детермінує конформацію аспартаткинази. У результаті фермент втрачає чутливість до концентрацій алостеричного інгібітору – лізину.

Технологія одержання.Як джерела вуглецю для культивування продуцентів лізину використовують вторинну сировину: бурякову мелясу, молочну сироватку, гідролізати крохмалю, сульфітні луги. Джерелами азоту є сечовина та солі амонію. Крім того, в живильне середовище додають необхідні для життєдіяльності макро- та мікроелементи (Р, Са, Mg, Mn, Fe та ін); стимулятори росту, в якості яких виступають екстракти кукурудзи, дріжджів та солодових паростків, гідролізати висівок та дріжджів, вітаміни групи В. Ступінь аерації індивідуальна для виробництва кожного конкретного продуцента.

Після завершення процесу ферментації (через 55 - 72 год) рідку фазу відокремлюють від культури клітин мікроорганізму фільтруванням і використовують для виділення з неї лізину.

Високоочищені препарати лізину отримують після фракціонування фільтрату культуральної рідини методом іонообмінної хроматографії на катіоніті. З цією метою лізин переводять у форму катіону:

Для цього процесу фільтрат обробляють соляною кислотою до рН 1,6 – 2,0. Володіючи двома позитивно зарядженими іоногенними угрупованнями, лізин міцно сорбується на смолі таелююється з неї у вигляді індивідуального з'єднання 0,5 - 5% розчином гідроксиду амонію після виходу всіх інших катіонів. Елюат концентрують у вакуумі при температурі 60 про З, переводять у форму монохлоргідрату, після чого висушують і додатково чистять за допомогою перекристалізації. В результаті отримують препарати кристалічного лізину 97 - 98% чистоти, які використовують для підвищення поживної цінності харчових продуктів і в медичній промисловості.

Крім високоочищених препаратів лізину отримують інші види його товарної форми: рідкий концентрат лізину (ЖКЛ), сухий кормовий концентрат лізину (ККЛ) та висококонцентровані кормові препарати, що характеризуються відносно меншим ступенем очищення порівняно з першим препаратом.

Виробництво триптофану.Метаболічний шлях і характеристика продуцентів.Подібно до лізину триптофан утворюється в ході розгалуженого метаболічного шляху (рис.8.3).

8.3. Метаболічний шлях синтезу триптофану

Однак при використанні ауксотрофних мутантів, у яких блоковані реакції, що ведуть до синтезу фенілаланіну та тирозину в середовищі, надмірне накопичення триптофану в середовищі не спостерігається, що пояснюється особливістю регуляції біосинтезу триптофану у мікроорганізмів. Метаболічним попередником триптофану служить антранілова кислота, яка виникає з хоризмової кислоти під дією антранілатсинтетази. Триптофан інгібує на антранілатсинтетазу, тому для обходу метаболічного контролю синтез ферменту індукують ступінчастим введенням попередника – антранілової кислоти.

У зв'язку з цією особливістю промислове виробництво триптофану організовано переважно за двоступінчастою схемою.

Технологіяодержання.На першому етапі хімічним способом синтезують антранілову кислоту, яку за допомогою ензиматичної системи мутантних штамів дріжджівCandida utilisпереводять у триптофан.

Після сушіння культуральної рідини одержують кормовий концентрат триптофану (ККТ), який включає білки, вільний триптофан, вітаміни В1 В2 та PP. Високоочищені кристалічні препарати триптофану утворюються після додаткового очищення культуральної рідини методом іонообмінної хроматографії на колонці, заповненій катіонітом (сорбція при рН 1,0; елюція 5% розчином гідроксиду амонію в суміші з пропанолом-2). Елюати кристалізують; кристали відмивають та висушують. Кристалічний препарат містить до 99% триптофану.

Крім триптофану мікробіологічним способом з використанням попередників отримують гістидин, ізолейцин, метіонін, серії та треонін.

Хіміко-мікробіологічний метод.В останні роки при виробництві амінокислот все ширше використовують біотрансформацію попередників амінокислот, за допомогою іммобілізованих ферментів або клітин мікроорганізмів, що попередньо одержуються хімічним шляхом.

Застосування ферментів у виробництві амінокислот забезпечує стереоспецифічність процесів їхнього синтезу, що вигідно відрізняє біотехнологічні виробництва від хімічних.

Отримання L-лізину.Процес отримання лізину заснований на стереоспецифічному ферментативному гідролізі (конверсії) D-, L-α-аміно-ε-капролактаму, який спочатку отримують хімічним шляхом із циклогексену:

Рацемат використовують як субстрат, який під дією ферменту L-α-аміно-ε-капролактамгідролази (лактамаза) перетворюється на L-лізин, а решта непрореагувала його частина (D-форма) перекладається при впливі рацемази всуміш антиподів:

Отримання триптофану.Хіміко-ферментативний спосіб отримання триптофану полягає у прямій конденсації індолу, аміаку та піровиноградної кислоти:

Реакцію каталізує піридоксальзалежна триптофаназа. Фермент знайдено убактерій Е. coli, Bacillus albei,Proteus rettgeriі характеризується широкою субстратною специфічністю. Додавання триптофану індукує утворення ферменту, а додавання індолу інгібує його синтез у бактерій, тому процес отримання триптофану ведуть при надлишку аміаку та пірувату. Вихід амінокислоти при реалізації хіміко-ензиматичного способу одержання триптофану становить 63 г/л.

Перелік цільових амінокислот, вироблених хіміко-ферментативним способом різноманітний (L-аспарагінова кислота, L-аланін, L-глутамін, L-лізин, L-тирозин, L-триптофан, L-цистеїн, L-фенілаланін, L-метіонін). Хіміко-ензиматичний спосіб у порівнянні з мікробіологічним більш специфічний, не вимагає процедури очищення амінокислот від побічних продуктів та стічних потоків. Однак за вартістю сировини та ферментативних препаратів він ще поступається мікробіологічним способом.

Застосування амінокислот.Крім застосування як харчових добавок, приправ та підсилювачів смаку амінокислоти використовують як сировину в хімічній, парфумерній та фармацевтичній промисловості та при виробництві ряду інших речовин: