Планета Життя-Ти маєш це знати! КОЖЕН ПОЗИТИВНИЙ ПРИ ELISA (ІФА) – ТЕСТУВАННЯ НА ВІЛ
Протягом останніх 6 років я працював у лабораторії клінічної імунології одного з найпрестижніших університетських шпиталів Нью-Йорка. Тут я мав можливість особисто виконувати та детально досліджувати сучасні тести, що використовуються для визначення ВІЛ-статусу – ELISA (ІФА), Western Blot (імуноблот) та ПЛР.
1. Розведення сироватки при використанні тесту ELISA
ELISA є тестом для визначення антитіл, які, як вважають, виробляються проти вірусу імунодефіциту людини (ВІЛ). Для проведення цього тесту сироватка пацієнта повинна бути розведена спеціальним розчином у співвідношенні 1:400. Відповідно до заявлених виробником параметрів, цей розчинник містить: 0,1% тринітротолуолу Х-100, коров'ячу та козячу сироватки (мінімальна концентрація – 5%), людські лізати Т-лімфоцитів (мінімальний титр 1:7500), консервант – азид натрію – 0,1% (1).
Необхідність такого надзвичайно великого розчинення сироватки пацієнта [400 разів] здивувала мене. У більшості серологічних тестів, що виявляють присутність антитіл до мікробів, використовується чиста сироватка [нерозлучена]. Наприклад, у тестах, що виявляють антитіла до вірусів гепатиту А і В, вірусу корової краснухи, сифілісу, гістоплазмі та криптококку, використовується звичайна сироватка [нерозлучена]. Проте, щоб уникнути хибнопозитивних реакцій, у деяких із серологічних тестах використовується розведена сироватка; наприклад у випадку проведених мною тестів на визначення антитіл до вірусів кору, вітряної віспи та свинки використовувалося розведення у співвідношенні 1:16, цитомегаловірусу – 1:20 і вірусу Епштейна-Барра – 1:10.
Виникають очевидні питання: що робить ВІЛ настільки унікальним, щотестовану сироватку необхідно розбавити у співвідношенні 1:400 і що станеться, якщо сироватка не буде розведена?
2. Випробування тесту ELISA без розведення сироватки
Щоб відповісти на ці запитання, я зробив експеримент у медичній лабораторії Йорктаун Хайтс (Yorktown Heights), що знаходиться в Нью-Йорку. При проведенні цього експерименту я використовував ті ж реагенти тест-систем, які зазвичай використовуються при постановці тесту ELISA у більшості клінічних лабораторій у всьому світі (1).
Спочатку я взяв зразки крові, які при розведенні у співвідношенні 1:400 дали негативний результат на антитіла до ВІЛ. Потім, використовуючи ті самі зразки сироватки, я зробив ще одне тестування, але цього разу не розбавляючи їх. Нерозбавлені, всі вони були позитивними.
Я протестував близько 100 зразків і весь час отримував такий же результат. Я протестував навіть власну кров, яка при розведенні 1:400 була негативною, але у співвідношенні 1:1 [незвільнена] показувала позитивну реакцію. Я маю згадати, що за винятком моєї власної крові, всі інші зразки [крові пацієнтів] були отримані від лікарів, які вимагали ВІЛ-тестування. Таким чином, найбільш імовірно, що більшість зразків крові протестованих мною належали особам, які схильні до ризику СНІДу.
Відповідно до Еббетт Лабротериз (Abbott Laboratories – один із провідних виробників тест-систем – прим. перекладача), «ступінь оптичної щільності [інтенсивність жовтого кольору] проявляється пропорційно до кількості пов'язаних антитіл до ВІЛ-1».
Що я помітив, це те, що ступеня оптичної щільності зразків, що давали негативний результат при розведенні [1:400], але позитивних при тестуванні нерозбавленими [1:1], мали більшенижчі значення, ніж ті зразки, які при розведенні були позитивні ELISA і Western Blot. Це, ймовірно, має означати, що кров, негативна при розведенні, але позитивна, будучи нерозведеною, має нижчий рівень антитіл, ніж розбавлена кров, що позитивно реагує в обох випадках і, таким чином, може бути негативною Western Blot [якщо розведена] . Проте, я не мав можливості перевірити цю гіпотезу.
Таблиця, розташована нижче, ілюструє те, як негативна реакція розведених у співвідношенні 1:400 зразків крові завжди змінюється на позитивну, при постановці досвіду зі зразком 1:1.
Проведення тесту ELISA для визначення наявності антитіл до ВІЛ при двох різних концентраціях сироватки пацієнтів
(a) Результати за 1:400
(б) Результати при 1:1
9112324b G5 0.076 ---
9112324b G5 0.262 реактивний
9112325b H1 0.081 ---
9112325b H1 0.259 реактивний
9112326b H2 0.071 ---
9112326b H2 0.329 реактивний
9112327b H3 0.060 ---
9112327b H3 0.401 реактивний
9112328b H4 0.073 ---
9112328b H4 0.345 реактивний
9112329b H5 0.062 ---
9112329b H5 0.343 реактивний
9112330b J1 0.060 ---
9112330b J1 0.234 реактивний
9112331b J2 0.077 ---
9112331b J2 0.306 реактивний
9112332b J3 0.067 ---
9112332b J3 0.248 реактивний
9112333b J4 0.086 ---
9112333b J4 0.222 реактивний
Колонка «а» демонструє 10 зразків, що прореагували негативно при концентрації 1:400. Колонка "б" демонструє ті ж 10 зразків, що прореагували позитивно при концентрації 1:1.
Важливо зауважити, що тест на антитіла до «ВІЛ» Western Blot також передбачає розведення плазми. Хочаі цей тест вимагає незвичайно великого ступеня розведення, але, в даному випадку, сироватка пацієнта розбавляється у співвідношенні лише 1:50 (2). До цього часу я не мав можливості провести тестування нерозбавленої [1:1] сироватки за допомогою Western Blot.
3. Дискусія
Можливі три пояснення того факту, що нерозбавлений зразок крові завжди позитивно реагує при тестуванні ELISA:
3.1. Антитіла є у кожного з нас
Загальноприйнято у всьому світі, що ВІЛ-тест ELISA визначає наявність антитіл до того, що відомо як вірус імунодефіциту людини (3, 4, 5, 6). І фармацевтичні компанії, що налагодили серійне виробництво тест-систем ELISA, стверджують, що: «Abbott HIVAB HIV-1 EIA є якісним імуноферментним аналізом для визначення in vitro антитіл до вірусу імунодефіциту людини типу 1 (ВІЛ-1) у людській сироватці та плазмі»(1) ). Оскільки всі нерозведені зразки крові реагують позитивно при тестуванні ELISA, тестом, який, імовірно, визначає наявність антитіл до ВІЛ, представлені тут результати мають на увазі, що кожна людина має антитіла до ВІЛ. І це передбачає, що кожна людина зазнала впливу ВІЛ-антигена.
Це могло б означати, що всі ми схильні до впливу вірусу, який, як вірять, є причиною СНІДу. Люди, реакція яких позитивна навіть при розчиненні [сироватки] у співвідношенні 1:400, були б тими, хто зазнав найбільшого ризику впливу ВІЛ-антигенів. Інші, – ті, хто чия реакція виявлялася при нерозчиненій сироватці, – були б тими, хто мав нижчий ризик схильності до ВІЛ.
3.2. Кожен із нас має різний рівень антитіл до ВІЛ
Також загальноприйнято у всьому світі, що особа реагуєпозитивно на антитіла до ВІЛ, не тільки схильне до ризику, але інфіковано смертоносним вірусом, який є причиною імунодефіциту (3, 4, 5, 6). Таким чином, позитивні реакції нерозбавлених зразків сироватки мали б на увазі, що кожен або, принаймні, всі ті обазці крові, які я тестував, включаючи мій власний, заражені «смертоносним» вірусом. Тільки ті зразки, які прореагували у співвідношенні 1:400, мають більш високу міцність «смертельної» інфекції, ніж ті, що були реактивні [позитивні – прим. перекладача] тільки при нерозведеній сироватці.
3.3. Тест не є специфічним для ВІЛ
Результати, представлені тут можуть також означати, що тести, що використовуються для визначення антитіл до ВІЛ не є специфічними для ВІЛ, як було викладено вище (7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14). У цьому випадку, повинні бути причини, відмінні від ВІЛ-інфекції, у цьому чи минулому, які б пояснювали чому ця особа реагує позитивно на цей тест. Цей тест показує позитивну реакцію, також, за відсутності ВІЛ (7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14).
У науковій літературі задокументовано понад 70 причин, відмінних від інфікування ВІЛ у минулому чи сьогоденні, за наявності яких можлива позитивна реакція (7, 10, 11, 14, 15). Всі ці причини мають одну загальну – поліантигенну стимуляцію (15, 16).
Навіть Еббетт Лебротеріз (Abbott Laboratories) добре обізнані про специфіку проблем тесту ELISA. Тому вони і заявляють: «EIA-тестування, само по собі, не може бути використане для діагностування СНІДу, навіть якщо рекомендоване дослідження реактивного зразка передбачає високу ймовірність наявності антитіл до ВІЛ-1» та «Незважаючи на застосування тесту EIA при всіх клінічних та загальних медичнихдослідження, як рівень реактивності сироватки, так і рівень ризику ВІЛ-1 для індивідуума можуть мати значення при інтерпретуванні тесту, не є досконалими кореляціями. Таким чином, у більшості випадків, слід досліджувати зразки, що відтворюються реагують, за допомогою інших, більш специфічних або додаткових тестів». (1)
Цікавий той факт, що в деяких країнах, наприклад у Великій Британії, діагностика ВІЛ-статусу проводиться тільки на підставі [результатів] тесту ELISA. Для цієї мети не проводиться тестування Western Blot або інші тести.
У зв'язку з тим, що не існує наукового доказу факту специфічності тесту ELISA до ВІЛ-антитіл, реактивний тест може означати наявність неспецифічних або поліспецифічних антитіл (20). Ці антитіла можуть бути присутніми у всіх зразках крові. Вони, найбільш ймовірно, є результатом стресової реакції і не мають жодного відношення до будь-яких ретровірусів, не кажучи вже про ВІЛ (21, 22). У цьому випадку, реактивний тест може бути мірилом рівня схильності до стресогенного фактора або оксидативним агентам (15, 16).
Неминучий висновок полягає в тому, що всі позитивні реакції на наявність антитіл до ВІЛ просто хибно позитивні. Якщо ніхто не є ВІЛ-позитивним, то ті, хто люди, чия реакція є позитивною при тестуванні ELISA, мають будь-які інші, відмінні від ВІЛ, причини для такої реакції.
4. Пропозиція щодо пошуку справжнього значення тестів на «ВІЛ-антитіла»
Результати цього експерименту могли б показати мають дані тести відношення до визначення схильності індивідуума стрес-факторам або оксидативним агентам. Якщо це припущення отримає своє підтвердження, то тестування могло б бутизбережено як інструмент вимірювання рівня інтоксикації індивідуума.
Дозвольте нам знайти економічну підтримку, необхідну для цього експерименту. У той же час, у зв'язку з тим, що люди реагують позитивно при проведенні тестів, які не є специфічними для ВІЛ, будь ласка, давайте зупинимо процес навішування на них ярликів «ВІЛ-позитивні».
Вираз подяки
Я хотів би подякувати пану Альберту Падовані (Mr. Albert Padovani), Директору медичної лабораторії Йорктаун за можливість проведення експериментів у його лабораторії та за надані реагенти. Я також висловлюю вдячність Тому ДіФердинандо, виконавчому директору Health Education AIDS Liaison (HEAL) у Нью-Йорку за редагування рукопису цієї статті та за його цінні зауваження.
Роберто А. Жіральдо (Roberto A. Giraldo), Доктор Медицини, спеціаліст з хвороб внутрішніх органів, інфекційних та тропічних захворювань. Член Ради директорів «Групи наукової переоцінки гіпотези ВІЛ-СНІД» і «Health Education AIDS Liaison» (HEAL). Незалежний дослідник СНІДу. Автор книги «СНІД та стресори», Нью-Йорк, 1997.