Ретикулоцити
Ретикулоїнти - молоді еритроцити, що утворюються після втрати нормобластами ядер. Характерною особливістю ретикулоцитів є наявність у цитоплазмі зернисто-нитчастої субстанції, що представляє агреговані рибосоми та мітохондрії. Ця субстанція виявляється при спеціальному методі забарвлення - суправітальному, тобто без попередньої фіксації клітин. Зерністо-нитчаста субстанція в різних ретикулоцитах відрізняється поліморфізмом: чим клітина молодша, тим субстанція більш рясна. У наймолодших ретикулоцитів вона має форму густого клубка, у зріліших клітин виявляється у вигляді сіточки, окремих ниток і потім окремих зерен. У мазках, пофарбованих звичайними гематологічними методами, ретикулоцити сірувато-рожевого кольору - поліхроматофільні, тобто пофарбовані різними барвниками.
Визначення кількості ретикулоцитів провадиться при мікроскопії спеціально забарвлених мазків.
Уніфікований метод підрахунку кількості ретикулоцитів після забарвлення їх діамантовим крезиловим синім, азуром I або азуром II безпосередньо на склі або в пробірці (1972).
Суправітальне забарвлення барвниками, що виявляють зернисто-нитчасту субстанцію ретикулоцитів.
Реактиви. Можна використовувати один із наступних барвників.
1.Насичений розчин діамантового крезилового синього в абсолютному спирті (для приготування абсолютного спирту треба витримати етанол 96% у кількох змінах прожареного порошку мідного купоросу). На 100 мл абсолютного спирту беруть 1,2 г фарби.
2. Розчин азура I, запропонований П. Н. Кориковим: азур 1 - 1 г, амонію оксалат - 0,4 г, натрію хлорид-0.8 г, етиловий спирт 96% 10 мл, дистильована вода - 90 мл. Розчин фарби в закритому флаконі поміщають на 2-3 дні термостат при 37 °С іперіодично енергійно збовтують. Потім охолоджують до кімнатної температури та фільтрують через паперовий фільтр. Розчин зберігають у посуді із темного скла. З появою осаду фарбу слід знову профільтрувати.
3. Розчин азура ІІ наступного складу: азур ІІ 1 г, натрію цитрат 5 г, натрію хлорид, 0,4 г, дистильована вода 45 мл. Розчин залишають у термостаті при 37 °С на 2 добу, періодично помішуючи. Для прискорення розчинення фарбу можна прогріти на слабкому вогні протягом 15-20 хв, не доводячи до кипіння. Охолоджують до кімнатної температури та фільтрую). Зберігають у посуді із темного скла.
Спеціальне обладнання. мікроскоп.
Добре вимите та знежирене предметне скло підігрівають над полум'ям пальника. Скляною паличкою наносять на скло краплю одного з барвників і готують мазок із фарби шліфованим склом. Маркують бік скла, на яку нанесено мазок фарби, склографом. У такому вигляді скла можна заготовити про запас і зберігати в сухому темному місці. Наносять краплю крові на мазок фарби, готують з неї тонкий мазок і відразу поміщають у вологу камеру на 3-4 хв (можна користуватися чашкою Петрі з покладеними по краях валиками змоченої вати або фільтрувального паперу). Потім висушують мазки повітря.
У приготовлених таким чином мазках еритроцити пофарбовані в жовтувато-зелений колір, зернисто-нитчаста субстанція - у синій колір.
Метод 1: перед вживанням готують у пробірці робочий розчин діамантового крезилового синього з розрахунку на краплю 1% розчину оксалату калію 4 краплі розчину фарби 1. У фарбу додають 0,04 мл крові (дві піпетки до мітки 0,02). Суміш ретельно, але обережно перемішують та залишають на 30 хв. Перемішують та готують тонкі мазки.
Метод 2: у пробірку поміщають 0,05 мл розчинуфарби 3 та 0,2 мл крові. Суміш ретельно перемішують і залишають на 20-30 хв. Перемішують та готують тонкі мазки.
Метод 3: в пробірку поміщають 03-05 мл розчину фарби 2 і 5-6 крапель крові піпеткою від апарату Панченкова. Пробірку накривають гумовою пробкою, суміш ретельно, але обережно перемішують і залишають на 1-2 години (краще забарвлюються ретикулоцити при експозиції 2-3 години). Перемішують та готують тонкі мазки.
У мазках еритроцити пофарбовані в жовтувато-зелений колір, зернисто-нитчаста субстанція в синій або синювато-фіолетовий колір.
Приготовлені одним із зазначених способів мазки мікроскопують з імерсійним об'єктивом. Необхідно підрахувати не менше 1000 еритроцитів і відзначити серед них кількість еритроцитів, що містять зернисто-нитчасту субстанцію. Практично для більшої точності користуються спеціальним окуляром, у якому можна зменшити поле зору до необхідних розмірів. При тонких тонких мазках, в яких еритроцити розташовані в один ряд, підбирають таке поле зору, в якому є, наприклад, 50 еритроцитів, і потім прораховують 20 таких полів зору.
За відсутності готового окуляра його можна легко приготувати, для чого окуляр 10Х відкручують, вкладають у нього шматок паперу з вирізаним невеликим квадратиком і загвинчують.
Кількість підрахованих ретикулоцитів виражають на 1000 або 100 еритроцитів.
Підрахунок кількості ретикулоцитів за допомогою люмінесцентної мікроскопії.
Використання здатності субстанції ретикулоцитів флюоресціювати після обробки крові акридиновим помаранчевим.
1. Розчин акридинового помаранчевого на ізотонічному розчині хлориду натрію та концентрації 1:5000. Для приготування ізотонічного розчину рекомендують використовувати дистильовануводу pH 5,8-6,8, Розчин акридинового помаранчевого має бути свіжим; зберігають його трохи більше 3—5 днів у темному флаконі з притертою пробкою.
2. Нефлюоресцентне іммерсійне масло.
Можна використовувати афлуоль або звичайну імерсійну олію з флюоресценцією, погашеною нітробензолом (0,3 мл нітробензолу на 1 мл олії). Ю. Н. Зубжицький як нефлюореспіруюча олія пропонує використовувати перегнаний анізол.
Спеціальне обладнання. Мікроскоп ультрафіолетовий МУФ-ЗМ чи люмінесцентний.
Кров змішують з акридиновим помаранчевим у пробірці або змішувачі у співвідношенні 1 частина крові та 10 частин фарби (суміш можна зберігати не більше 5 год). Суміш перемішують протягом 2 хв, краплю суміші наносять на предметне скло та накривають покривним склом.
Мікроскопують за допомогою світлофільтру ЖС-17.
У препараті еритроцити не флюоресцують, а в ретикулоцитах зернисто-нитчаста субстанція світиться яскраво-червоним кольором.
Помічено, що у крові, стабілізованої гепарином чи цитратом натрію, флюоресценції ретикулоцитів немає.
Метод відрізняється простотою і потребує небагато часу; завдяки яскравому світінню ретикулоцити легко підрахувати.
Нормальні величини. У здорових число ретикулоцитів становить 2 -12 проміле, або 02-12%.
Кількість ретикулоцитів у крові відбиває регенеративні властивості кісткового мозку, і його широко використовується при різних анеміях (див. табл. 24). Підвищення кількості ретпкулоцитів спостерігається після крововтрати, при гемолітичних анеміях, особливо в період кризу (кількість ретикулоцитів може бути 20 -30%), а також на фоні лікування анемії Аддісона Бірмера вітаміном В12 (ретикулоцитарний криз - підйом числа ретикулоцитів на 4-8-й лікування). Зниження кількості ретикулоцитівхарактерно для гіпопластичної анемії, рецидиву анемії Аддісона-Бірмера
Визначення кількості ретикулоцитів може бути використане для визначення продукції еритропоезу та обчислення терміну життя еритроцитів.
Література Гомзякова Н. В. Лаб, справа, 1960 № 5, с. 38-39;
Зубжицький Ю. Н. Лаб. справа; 1967 № 2, с. 35;