Робота №31 Визначення активності альфа-амілази методом Каравею
Принцип методу. Метод базується на колориметричному визначенні концентрації крохмалю до та після його ферментативного гідролізу.
Реактиви
1. Розчин субстрату рН 72-74. 13,3 г безводного двузамещенного натрію фосфорнокислого і 4,3 г бензойної кислоти вносять в 250 мл доведеної до кипіння дистильованої води і деякий час кип'ятять розчин. Суспендують 0,2 г «розчинного» крохмалю в невеликій кількості холодної води і вливають у киплячу суміш, підтримують її в такому стані протягом 1 хв. Потім суміш охолоджують та доводять водою до 500 мл.
Розчин стійкий при кімнатній температурі, але його бажано готувати заново кожні дві доби або двічі на тиждень. Він має зберігати прозорість. Слід звертати особливу увагу на показник рН приготовленого субстрату (має бути не менше 6,8). Для доведення рН розчину до необхідних значень (7,2—7,4) можна змінити співвідношення між кількістю фосфату натрію і бензойної кислоти, що використовується для його приготування, або у разі отримання кислого розчину додати 5 н розчин NaOH.
2. 0,1 н основний розчин йоду, який може бути одержаний наступними способами: а) з фіксаналу; б) із кристалічного йоду та йодистого калію: 30 г KI розчиняють у 250 мл дистильованої води, туди ж вносять 12,7 г йоду і доводять об'єм дистильованою водою до 1000 мл. Отриманий розчин (Люголя) зберігають у темряві, він стійкий; в) з йодату калію та йодистого калію: 3,567 г йодноватокислого калію (КЮз) і 45 г KI розчиняють у 800 мл води і повільно, при помішуванні, додають 9 мл концентрованої соляної (хлористоводневої) кислоти, а потім доливають водою до об'єму.
4. Робочий (0,01 н) розчин йоду. 25 г фтористого калію розчиняють у 350 w води,вводять 50 мл основного розчину йоду та доводять водою до об'єму 500 мл. Придатність розчину - близько 2 місяців за умови зберігання в посуд з темного скла в холодильнику. Робочий розчин йоду без додавання до нього фтористого калію слід готувати щодня.
Хід визначення У звичайну хімічну пробірку вносять 1 мл розчину крохмалю, субстрат прогрівають 5 хв у водяній бані при 37°С, після чого до нього додають 0,02 мл негемолізованої сироватки. Пробу знову поміщають рівно на 5 хв у водяну баню (у сухоповітряному термостаті для цього мають бути баночки з водою). Контрольну пробу проводять так само, як дослідну, але сироватку до неї не вносять. Потім у всі пробірки (досвідчені і контрольні) доливають по 1 мл робочого розчину йоду і по 8 мл дистильованої води, пробірки добре збовтують і розчини, що містяться в них, колориметрують на будь-якому фотометрі, наприклад ФЕКе, з червоним світлофільтром (630-690 нм) в кю із шириною шару 10 мм. При врахуванні оптичної щільності проб як розчин для порівняння використовують дистильовану воду. Розраховують активність альфа-амілази в г розщепленого крохмалю на 1 л сироватки за 1 годину інкубації при +37"С за формулою:
де 240 є величина, одержувана множенням 0,4 (кількість крохмалю, мг, внесеного в дослідну та контрольну проби) на 600; 600 = 50 • 12 (50-коефіцієнт перерахунку на кількість крохмалю в г, гідролізованого 1 л сироватки), 12 - коефіцієнт перерахунку з 5 хв на 60 хв.
норми: активність ферменту в сироватці крові - 16-30 г/(год • л), сечі - 28-160 г/(год • л), у середньому - 107±5,1 г/(год • л).
Примітки.
1. Для визначення активності альфа-амілази рекомендується використовувати свіжу сироватку та сечу. Поряд із твердженням, що активність ферменту стабільна прикімнатної температури протягом тижня, а при 4°С або при -20°С протягом місяця, є відомості і про те, що вона знижується вже через кілька годин зберігання біологічного матеріалу, як при кімнатній температурі, так і при 4°С.
2. Слабкий гемоліз не заважає дослідженню.
3. Лимоннокислу та щавлевооцтову плазму та плазму, приготовлену на ЕДТА, застосовувати не можна, оскільки цитрати та оксалати інгібують активність ферменту.
4. Бажано ставити контрольну пробу на кожну сироватку, що досліджується, вносячи її в пробірку після періоду інкубації.
5. Інтенсивність фарбування йодокрахмального розчину обернено пропорційна коливанням температури. Тому треба стежити за тим, щоб у дослідній та контрольній пробі під час кольорової реакції температура була постійною.
6. Профільтровану сечу можна використовувати і нерозведеною. Однак при активності ферменту вище 140 г/(год./л) сечу слід розвести (або вкоротити період її інкубації), що відповідно має враховуватись при розрахунку активності ферментів. У разі високої гіперферментемії сечу розводять у 100 разів.
7. Нормальні показники активності ферменту для сироватки крові та сечі бажано перевіряти на донорах у кожній лабораторії.
8. При визначенні амілазної активності потрібно мати на увазі, що слина містить у 1000 та 10 000 разів більше ферменту, ніж сироватка. Піт також має амілазну активність. Так, при закриванні пробірки, що струшується в руках, великим пальцем активність амілази в аналізованій пробі зростала на 25—80%.
9. Активність альфа-амілази підвищують іони кальцію.
10. Якщо визначення активності альфа-амілази сечі відкладається більш ніж на 1 годину після взяття крові, сеча повинна бути заморожена.
11. Хід ферментативної реакції убагато в чому залежить від якості субстрату, що використовується.