Серологічні реакції з використанням мітки
Нині широко застосовуються серологічні реакції, у яких беруть участь мічені АГ-и чи АТ-ла. До них відносяться реакції імунофлюоресценції, радіоімунний та імуноферментний методи.
1) для серодіагностики інфекційних захворювань, тобто для виявлення АТ за допомогою набору відомих кон'югованих (хімічно з'єднаних) з різними мітками (ферментами, флюорохромними барвниками) антигенів;
2) для визначення мікроорганізму або його серовару за допомогою стандартних мічених діагностичних антитіл (експрес-діагностика).
Готують сироватки імунізацією тварин відповідним АГ-м, потім виділяють імуноглобуліни і кон'югують їх зі барвниками, що світяться (флюорохромами), ферментами, радіоізотопами.
Мічені СР за специфічністю не поступаються іншим СР, а за своєю чутливістю вони перевершують усі СР.
Немає подібних матеріалів
Як мітки використовуються флюорохромні барвники, що світяться (ізотіоцінат флюорисцеїну та ін.).
Існують різні модифікації РІФ. Для експрес-діагностики інфекційних захворювань - для виявлення мікробів або їх антигенів у матеріалі, що досліджується, застосовується РІФ по Кунсу.
Виділяють два методи РІФ за Кунсом: прямий і непрямий.
Компоненти прямої РІФ:
1) досліджуваний матеріал (випорожнення, що відокремлюється носоглоткою та ін);
2) мічена специфічна імунна сироватка, що містить АТ-ла до шуканого антигену;
3) ізотонічний розчин натрію хлориду.
Мазок з досліджуваного матеріалу обробляють міченою антисироваткою.
Відбувається реакція АГ-АТ. Прилюмінесцентне мікроскопічне дослідження в тій ділянці, де локалізуються комплекси АГ-АТ, виявляють флюоресценцію - світіння.
Компоненти непрямої РІФ:
1) досліджуваний матеріал;
2) специфічна антисироватка;
3) антиглобулінова сироватка (АТ-ла проти імуноглобуліну), мічена флюорихромом;
4) Ізотонічний розчин хлориду натрію.
Мазок з досліджуваного матеріалу спочатку обробляють імунною сироваткою до антигену, а потім - міченою антиглобулінової сироваткою.
Комплекси АГ-АТ, що світяться, - мічені АТ виявляються за допомогою люмінесцентного мікроскопа.
Перевага непрямого методу полягає в тому, що немає необхідності приготування широкого набору флюоресцирующих специфічних сироваток, а застосовується лише одна антиглобулінова сироватка, що флюорескує.
Також виділяють 4-компонентний різновид непрямий РІФ, коли додатково вводиться комплемент (сироватка морської свинки). При позитивній реакції утворюється комплекс АГ-АТ – мічені – АТ-комплемент.
РИФ заснована на з'єднанні антигенів бактерій, рикетсій і вірусів зі специфічними антитілами, міченими флюоресцирующими барвниками ( флуоресцеїнізотиоціанат , родамін, В-ізотиціаніт , лиссатинродамін В-200, сульфохлорідіохлор і ін.) іт та ін) . Ці групи з'єднуються з вільними аміногрупами молекул антитіл, які не втрачають при обробці флуорохромом специфічної спорідненості до відповідного антигену. Утворені комплекси АГ-АТ стають добре видимими структурами, що яскраво світяться під люмінесцентним мікроскопом (рис. 7). За допомогою РІФ можна виявляти невеликі кількості бактеріальних та вірусних антигенів. Метод РІФ використовують у двох варіантах:прямий та непрямий метод.
Прямий метод заснований на безпосередньому поєднанні антигену з міченим антитілом. Непрямий метод – на поетапному виявленні комплексу АГ-АТ за допомогою флуоресцентних барвників. Перший етап полягає у освіті імунних комплексів певного антигену зі специфічними антитілами. Другий етап - у виявленні цього комплексу шляхом обробки його міченим антигаммаглобуліном.
Перевага РІФ – простота, висока чутливість, швидкість отримання результату. РІФ застосовується як метод ранньої експрес-діагностики грипу, дизентерії, малярії, чуми, туляремії, сифілісу та ін. Для проведення такого дослідження використовується люмінесцентний мікроскоп.
Радіоімунологічний аналіз (РІА)
РІА - один із найчутливіших методів імунодіагностики. Його застосовують для виявлення антигену вірусу гепатиту В, у хворих на вірусний гепатит. Для цього до досліджуваної сироватці додають референс-сироватку (сироватку, що містить антитіла до вірусу гепатиту В). Суміш інкубують 1-2 доби при температурі 40 °С, потім додають референс-антиген (антиген, мічений ізотопом 125 J) та продовжують інкубацію ще 24 години. До комплексу, що утворився, антиген-антитіло додають преципітуючі антиімуноглобуліни проти білків референс-сироватки, що призводить до утворення преципітату (рис. 8). Результат враховують за наявністю та числом імпульсів у преципітаті, зареєстрованих лічильником. За наявності в досліджуваній сироватці антигену, що зв'язався зі специфічними антитілами, останні не вступають у зв'язок з міченим антигеном і тому він не виявляється в преципітаті. Таким чином, в основу РІА покладено принцип конкурентної взаємодії визначеного антигену та відомої кількості міченого антигену з активними центрами антитіл.мітки використовуються радіоактивні ізотопи.
Залежно від техніки постановки виділяють два способи РІА.
1) Техніка "рідка фаза" (класичний РІА). Недолік цієї техніки постановки – необхідність
спеціального поділу вільного та зв'язаного міченого антигенів (або антитіл).
2) Техніка "тверда фаза".
АГ або АТ відомої специфічності зв'язуються на сорбентах (твердій фазі) - стінках полістиролової лунки або пластикової пробірки. На іммобілізований АГ (АТ) послідовно-ватепно сорбуються інші компоненти ІЧ.
Залежно від характеру реакції розрізняють такі методи:
1) Конкурентний метод - метод, заснований на конкуренції АГ.
а) визначається АГ (досліджуваний матеріал - кров, мокротиння та ін);
б) ідентичний до досліджуваного АГ антиген, мічений радіоізотопом;
в) специфічні АТ-ла відомої концентрації, пов'язані на сорбенті;
г) стандартний АГ (контрольний);
д) буферний розчин.
2) Неконкурентний спосіб.
а) визначається АГ;
б) специфічний АТ-а відомої концентрації, пов'язаний з
ні на сорбенті;
в) ідентичні до зв'язаного антитіла антитіла, мічені
г) стандартний АГ;
д) буферний розчин.
До зв'язаних АТ додають АГ, що досліджується. У процесі інкубації на сорбенті утворюються комплекси АГ-АТ. Сорбент відмивають від вільних компонентів та додають мічені АТ, які зв'язуються з вільними валентностями АГ-на у складі комплексу. Розмір радіоактивності пропорційна концентрації досліджуваного АГ.
3) «Сендвіч-метод» (непрямий метод) – найпоширеніший метод.
а) досліджувана сироватка (або досліджуваний артеріальна гіпертензія);
б) АГ-и, пов'язані на сорбенті (або АТ-ла, пов'язані на сорбенті привизначення АГ-а);
в) діагностичні АТ проти імуноглобулінів, мічені радіоізотопами;
г) контрольні сироватки (або АГ-и);
д) буферні розчини.
Досліджувані АТ-а (або АГ-и) реагують з твердофазними АГ-ми (АТ-ми), після чого інкубат видаляється і реакцію вводять мічені антиглобулінові АТ, які зв'язуються зі специфічними комплексами АГ-АТ на поверхні сорбенту. Розмір радіоактивності реакції прямо пропорційна кількості досліджуваного АТ (чи АГ).
1) висока специфічність та чутливість;
2) простота техніки постановки;
3) точність кількісної оцінки результатів;
4) легко піддається автоматизації.
Недоліки: використання радіоактивних ізотопів.
Немає подібних матеріалів(
Імуноферментний метод (ІФА)
Метод використовується для виявлення антигенів за допомогою відповідних антитіл, кон'югованих з ферментом-міткою (пероксидазою хрону, b - галактозою або лужною фосфатазою). Після з'єднання антигену з міченою ферментом імунною сироваткою в суміш додають субстрат та хромоген. Субстрат розщеплюється ферментом, яке продукти деградації викликають хімічну модифікацію хромогену. При цьому хромоген змінює свій колір - інтенсивність забарвлення прямо пропорційна кількості молекул антигену і антитіл, що зв'язалися (рис. 9).
Найбільш поширений твердофазний ІФА, при якому один із компонентів імунної реакції (антиген або антитіло) сорбований на твердому носії. Як твердий носій використовуються мікропанелі з полістиролу. При визначенні антитіл у лунки з сорбованим антигеном послідовно додають сироватку крові хворих, антиглобулінову сироватку, мічену ферментом та суміш розчинів субстрату для ферменту та хромогену. Кожен разпісля додавання чергового компонента з лунок видаляють реагенти, що не зв'язалися шляхом ретельного промивання. При позитивному результаті змінюється колір хромогену розчину. Твердофазний носій можна сенсибілізувати як антигеном, а й антитілом. Тоді в лунки з сорбованими антитілами вносять шуканий антиген, додають імунну сироватку проти антигену, мічену ферментом, а потім - суміш розчинів субстрату для ферменту та хромогену.
ІФА застосовують для діагностики захворювань, викликаних вірусними та бактеріальними збудниками. Як мітку використовуються ферменти: пероксидаза, лужна фосфатаза та ін.
Індикатором реакції є здатність ферментів викликати кольорові реакції при дії відповідний субстрат. Наприклад, субстратом для пероксидазу є розчин ортофенілдіаміну.
Найбільш широко застосовується твердофазний ІФА. Сутність ІФА аналогічна РІА.
Результати ІФА можна оцінити візуально та вимірюванням оптичної щільності на спектрофотометрі.
До переваг ІФА слід віднести:
- Відсутність контакту з радіоактивними речовинами;
- Простота методів оцінки реакції;
- Легко піддається автоматизації.
Однак, порівняно з РІА, відзначають нижчу чутливість методу, але в деяких випадках чутливість перевищує РІФ та РІМ.
Як приклади наводяться такі типи ІФА:
Призначена для виявлення поверхневого антигену вірусу гепатиту В (НВЗ Пекло) у сироватках та плазмі крові при діагностиці вірусного гепатиту В та визначення носійства НВ5 Пекло.
1) досліджуваний матеріал сироватка чи плазма крові;
2) антитіла до НВЗ Пекло, адсорбовані на поверхні лунки полістиролового мікропланшета;
3) коньюгат - мишачі моноклоніальніантитіла до НВЗ Пекло, мічені пероксидазою,
4) ортофенілендіамін (ОФД)-субстрат;
5) фосфатно-сольовий буфер;
6) контрольні сироватки:
- Позитивна (сироватка з НВе Пекло);
- Від'ємна (сироватка без НВз Пекло). Хід роботи
1) Внесення контрольних та досліджуваних сироваток.
2) Інкубація 1 годину за 37 «З.
3) Відмивання лунок.
4) Внесення кон'югату.
5) Інкубація 1 годину за 37 «З.
6) Відмивання лунок.
7) Внесення ОФД. За наявності НВз Пекло розчин у лунках жовтіє.
Облік ІФА проводять за оптичною густиною за допомогою фотометра. Ступінь оптичної щільності буде обернено пропорційної концентрації досліджуваних НВз Пекло.
Реакція протікає у три фази:
1) НВз Пекло досліджуваної сироватки (плазми) зв'язується з гомологічними АТ, адсорбованими на поверхні лунки. Утворюється ІЧ АГ-АТ. (НВз Пекло - агл \ НВз АТ).
2) Антитіла НВз Пекло, мічені пероксидазою, зв'язуються з вільними детермінантами НВз Пекла комплексу АГ-АТ, що залишилися. Утворюється комплекс АТ-АГ-мічені АТ
3) ОФД взаємодіють (з пероксидазою) комплексу АТ-АГ-АТ та відбувається жовте фарбування.
Є основною тестовою реакцією діагностики ВІЛ-інфекції.
Ціль: серологічна діагностика ВІЛ-інфекції - виявлення антитіл до антигенів ВІЛ, Компоненти: