Спосіб експрес-діагностики кашлюку
Власники патенту UA 2247388:
Винахід відноситься до лабораторної діагностики і може бути використане для встановлення раннього етіологічного діагнозу. Сутність винаходу полягає в тому, що дослідження проводять у браш-біоптаті слизової задньої стінки глотки, в реакції непрямої імунофлуоресценції визначають наявність антигену кашлюкової палички і специфічного секреторного імуноглобуліну A (IgA) і при одночасному виявленні в досліджуваному матеріалі антигену кашлюк. Технічним результатом є підвищення точності діагностики та укорочення термінів постановки діагнозу.
Винахід відноситься до галузі медицини, зокрема до лабораторної діагностики кашлюку, і може бути використане в практиці охорони здоров'я при постановці раннього етіологічного діагнозу.
Коклюш продовжує залишатися актуальною проблемою охорони здоров'я, оскільки незважаючи на активну імунізацію дитячого населення в даний час мають місце високі показники захворюваності та повсюдне поширення з епідемічними підйомами, що періодично реєструються. За даними ВООЗ у світі щорічно реєструється понад 60 млн випадків та понад 500 тис. летальних випадків. Захворюваність на кашлюк по Україні зросла на 32%.
На сучасному етапі кашлюк характеризується важким перебігом у дітей раннього віку з розвитком загрозливих для життя ускладнень, формуванням резидуальних наслідків і летальністю, що зберігається. Нерідко має місце атиповий перебіг кашлюку у дітей старшого віку та дорослих, як правило, у щеплених дітей та у дітей із незавершеною схемою імунізації.
Частота реєстрації, різноманіття клінічних форм, поява диких збудників кашлюку, низький відсоток бактеріологічногопідтвердження клінічного діагнозу обґрунтовують необхідність розробки та впровадження нових сучасних методологічних підходів, що забезпечують постановку своєчасної та кваліфікованої етіологічної діагностики кашлюку.
Відомий метод культуральної діагностики кашлюку, при якому проводиться посів досліджуваного матеріалу на оптимальні живильні середовища та виділення чистої культури з подальшою ідентифікацією збудника.
Разом з тим, незважаючи на те, що виділення культури B.pertussis є абсолютним тестом для встановлення етіологічного діагнозу, метод має ряд недоліків. Виділення культури B.pertussis вимагає високоефективних селективних живильних середовищ та біполярного мікроскопа, що ускладнює його широке використання. Крім того, метод відрізняється трудомісткістю та низькою ефективністю, не забезпечує точності та відрізняється тривалістю проведення аналізу: на його виконання потрібно від 5 до 7 днів, метод малоефективний, висівання становить 11-20% у висококваліфікованих лабораторіях [Тимченко В.М. Кашлюк у дітей у сучасних умовах // Навчально-методичний посібник. – СПб.: ДПМА, 2000. – 20 с.].
Відомий також метод ретроспективної серологічної діагностики на основі непрямої реакції гемаглютинації з використанням діагностичних препаратів вітчизняного виробництва. Сутність методу полягає у виявленні у досліджуваних парних сироватках специфічних антитіл, які забирають на 2-3 тижні захворювання з інтервалом 1-2 тижні. Але незважаючи на його явні переваги перед культуральним методом відрізняється трудомісткістю, низькою ефективністю, не забезпечує точності, відрізняється тривалістю проведення аналізу, так як антитіла виявляються в крові тільки з другого тижня хвороби, діагностичне значення методсерологічної діагностики може лише вивчення характеру гуморального специфічного відповіді, досліджуючи парні сироватки у поступовій динаміці захворювання. Крім того, виконання його потребує парентерального втручання. [Інструкція з бактеріологічних та серологічних досліджень при кашлюку та паракоклюші, МОЗ СРСР, Москва, 1983].
Найбільш близьким до винаходу є спосіб діагностики кашлюку методом непрямої імунофлюоресценції з використанням ослячої діагностичної сироватки, описаний у методичних рекомендаціях Казанського державного медичного інституту ім. С.В.Курашова [Амфітеатрова Н.Ф. із співавт. Нові методи ранньої та експрес-діагностики кашлюку. Мет. рекомендації. - Казань, 1992]. Матеріалом для дослідження є слиз із задньої стінки глотки, 48-72 годинні підозрілі колонії з первинних посівів, виділені чисті культури, змив 5-добових первинних посівів із середовища вирощування після отримання негативних результатів бактеріологічного дослідження. Готують 3 препарати: 1 дослідний (досліджуваний субстрат) та 2 для контролю імунологічної специфічності (рідкий кашлюковий діагностикум). Після фіксації в 96° етиловому спирті на підсушені препарати нашарують ослячу діагностичну коклюшну аглютинуючу сироватку і витримують у термостаті при 37°С протягом 15 хвилин. Потім на дослідний препарат і препарат, що використовується як позитивний контроль, нашаровують люмінесцентну сироватку проти глобулінів осла, а на препарат, що використовується як негативний контроль, нашаровують люмінесцентну сироватку проти глобулінів коня. Далі препарати витримують у вологій камері при 37°С протягом 15 хвилин і переглядають під мікроскопом люмінесцентним.
Цей спосіб дозволяє отримати результат аналізу через5 годин, дає позитивні результати у 67% випадків при дослідженні з першого по десятий тиждень хвороби (максимум позитивних результатів може бути отриманий на ранніх термінах обстеження). Разом з тим, цей спосіб досить трудомісткий, пропонує одночасне дослідження проб від хворого, підозрілих колоній 48-72 первинних посівів та змив 5-добових первинних посівів з середовища вирощування, що уповільнює аналіз і змушує накопичувати проби, не забезпечує точності та відрізняється тривалістю проведення аналізу , не дає прогнозу перебігу захворювання та не дозволяє оцінити морфофункціональний стан слизової оболонки фарингеального епітелію.
Технічний результат винаходу полягає у підвищенні точності та експресності.
Авторами вперше запропоновано спосіб експрес-діагностики кашлюку, який дозволяє поставити попередній діагноз вже через 2 години після взяття браш-біоптату у хворого на аналіз, ґрунтуючись на результатах реакції непрямої імунофлюоресценції (РНІФ), причому запропонований спосіб може бути використаний у практиці будь-якої бактеріологічної лабораторії. а постановка РНІФ на предметному склі дозволяє проводити аналіз окремого зразка браш-біоптату від хворого відразу після взяття матеріалу на аналіз.
Авторами вперше запропоновано використовувати як досліджуваний матеріал браш-біоптат слизової з задньої стінки глотки, так як це більш інформативний матеріал, який дозволяє при одноразовому заборі отримати достатню кількість епітеліальних клітин (1000000 клітин/мл), на відміну від методу, запропонованого Н.Ф. .Амфітеатрової, яка використовує як досліджуваний матеріал змив із задньої стінки глотки.
Відповідно до винаходу на відміну від вищевказаних способів пропонується здійснювати постановку реакції непрямоїімунофлюоресценції безпосередньо на епітеліоцитах, зафіксованих на предметному склі Підвищення чутливості запропонованого методу виявлення корпускулярних антигенів кашлюкової палички в біологічному матеріалі досягається використанням комплексу методичних прийомів. Так, після фіксації ацетоном проводиться обробка епітеліоцитів 1% розчином бичачого сироваткового альбуміну на ФСБ (рН 72-74), що передує нанесенню специфічних антитіл, усуває неспецифічні фактори, наявні на епітеліоцитах. Крім того, пропонований метод дозволяє оцінити морфофункціональний стан слизової оболонки фарингеального епітелію за наступними закономірностями: наявність зруйнованих епітеліцитів і ниток фібрину, присутність мононуклеарів та виражена вакуолізація епітеліцитів, наявність полінуклеарів з фагоцитарною активністю. Виявлені морфофункціональні зміни стану фарингеального епітелію ротоглотки дозволяють встановити супутню патологію ротоглоткового кільця. Крім цього метод дозволяє зробити прогноз перебігу захворювання з оцінки місцевого специфічного імуноглобуліну А: імуноглобулін А відсутній при затяжних формах кашлюку, тоді як визначається в достатній концентрації при легких та середньотяжких формах кашлюку.
Запропонований вперше комплекс методичних прийомів, що виконуються у процесі виявлення корпускулярних антигенів кашлюкової палички на епітеліоцитах, є обов'язковим. Невиконання їх спотворює результати і не дозволяє дати об'єктивну оцінку результатів для встановлення діагнозу, не забезпечує точності.
Пропонований спосіб експрес-діагностики кашлюку здійснюють наступним чином. Доставлені в лабораторію браш-біоптати слизової оболонки фарингеального епітелію (гортанно-глоточний змив) послідовно наносять на предметне склоу вигляді двох крапель d=0,5 мм, перша крапля служить виявлення антигенів, друга - виявлення специфічного секреторного імуноглобуліну А, поруч постановки позитивного (третя крапля) і негативного (четверта крапля контролю) наносять дві краплі d=0,5 мм добової культури кашлюкової палички. Потім проводять фіксацію в ацетоні за +4°С протягом 10-20 хвилин. Індикацію корпускулярних антигенів кашлюкової палички та специфічного секреторного імуноглобуліну А проводять у реакції непрямої імунфлюоресценції (РНІФ). При постановці РНІФ на зафіксовані ацетоном препарати наносять діагностикум: в першу і третю (позитивний контроль) краплі додають гіперімунну людську сироватку, в другу краплю додають добову культуру кашлюкової палички, четверту - сироватку, що не містить антитіл до кашлюкової палички (негативний Препарати поміщають у вологу камеру (чашки Петрі з зволоженою ватою) та інкубують у термостаті при 37°С протягом 20 хвилин. Після інкубації препарати промивають струменем водопровідної води (з метою видалення незв'язаної з коклюшним корпускулярним антигеном гіперімунної коклюшної сироватки), обполіскують у двох порціях ФБР (рН 7,2-7,4), підсушують. Підсушені препарати (другий етап реакції) потім підфарбовують антивидовою люмінесцентною сироваткою з одночасним контрастуванням. Для цього у всі чотири краплі додають сироватку проти глобулінів людини з альбуміном, міченим родаміном. Препарати поміщають у вологу камеру, інкубують у термостаті при 37°С протягом 20 хвилин і двічі промивають по 5 хвилин у ФБР (рН 7,2-7,4), обполіскують дистильованою водою і підсушують на повітрі. Об'єм крапель для аналізу 20-50 мкл. Облік результатів реакції проводиться в світлі, що падає, на люмінесцентних мікроскопах різної системи. Прироботі на люмінесцентному мікроскопі МЛ-2 використовують систему світлофільтрів БС-2, ФС-4, С3С7-2, імерсійні об'єктиви, позначені буквою "Л" (90), апертура діафрагми 1,25; окуляр 7° або 10°, сила струму на пульті при мікроскопі 4,5 А. Оцінка інтенсивності світіння проводиться за чотириплюсовою системою:
++++ - дуже яскрава люмінесценція по периферії мікробної клітини, що чітко контрастується з тілом клітини.
+++ - яскрава люмінесцентна периферія клітини.
світіння периферії клітини.
(мінус) – люмінесценція клітин відсутня.
Позитивним результатом вважається яскрава флюоресценція із зеленим світлом по периферії (в області оболонки коклюшної палички), що чітко контрастує з темним тілом клітини, при негативному результаті в контрольній частині мазка. Морфологія виду, як правило, зберігається. Оцінка препарату повинна проводитися комплексно з урахуванням таких показників, як яскравість та колір специфічної флюоресценції, локалізація та структура свічення (свічення оболонки), а також кількість адгезованих на епітеліоцитах кашлюкових паличок у полі зору.
Аналіз відомих способів на дату подання заявки показує, що не існує подібних способів, що дозволяють виявити корпускулярні антигени кашлюкової палички безпосередньо на фарингеальних епітеліоцитах, колонізованих B.pertussis. Це дозволяє зробити висновок про суттєвість відмінностей заявляється способу. Пропонований спосіб експрес-діагностики кашлюку дозволяє, ґрунтуючись на результатах реакції непрямої імунофлюоресценції на епітеліоцитах, поставити попередній діагноз через 2 години після взяття матеріалу на аналіз. Забір матеріалу виключає парентеральне втручання, постановка реакції та облік результатів не потребують дорогого обладнання, забезпечує точність.
Як докази наводимо такі приклади:
1. Х. Ліза, 1 рік 4 міс. і/б 1083, д-з: ГРВІ, бронхіт:
Кров РА титр протиоклюшних антитіл 1/256 (3 тижні хвороби). Культуральний метод заперечень. (5 діб) Біоптат РНІФ покладе. (2 години).
2. С. Соня, 2 роки 6 міс, та/б 2255, д-з: ГРВІ, обструктивний бронхіт:
Кров РА титр протиоклюшних антитіл 1/64 (2 тижні хвороби). Культуральний метод заперечень. (5 діб) Біоптат РНІФ покладе. (2 години).
3. П. Марина, 16 років, № аналізу 97, д-з: бронхіт, тривалий кашель (10 днів): Кров РА титр протиоклюшних антитіл 1/16 (2 тиждень хвороби). Культуральний метод заперечень. (5 діб) Біоптат РНІФ покладе. (2 години).
Наведені приклади свідчать про високу чутливість та експресність розробленого методу, його точності.
Крім того, апробація способу на клінічному матеріалі дітей з діагнозом: "Коклюш" та іншими нозологічними формами (бронхіт, ГРВІ, "тривалі кашляють") показала його високу специфічність і чутливість. Позитивні результати отримані як на початковій стадії розвитку захворювання, так і при тривалому, тривалому перебігу захворювання, після декількох курсів антибактеріальної терапії, на відміну від культурального способу (таблиця).