Спосіб інактивації вірусу імунодефіциту людини та інших вірусів у плазмі крові людини з
Винахід відноситься до медицини. Проводиться холодова денатурація вірусних патогенів у препаратах плазми крові людини, що знаходиться під підвищеним гідростатичним тиском 2500 атм, після чого її охолоджують до температури (-15)-(-20)°С. Винахід може бути використаний для інактивації вірусних патогенів у препаратах плазми зі збереженням функціональної активності білкової частини препаратів плазми. 1 табл.
Малюнки до патенту Україна 2152994
Винахід відноситься до медицини та може бути використане для інактивації вірусних патогенів у препаратах плазми зі збереженням функціональної активності білкової частини препаратів плазми.
Відомий спосіб інактивації вірусних патогенів поступовою, багатостадійною тепловою обробкою препаратів крові (фібриноген та фактори VIII, IX) [2].
Відомий спосіб інактивації вірусів Ебола [3] і СНІДу [4] впливом світлом, що відповідає довжинам хвиль, рівним довжинам хвиль випромінювання магнію та цинку, відповідно. Відбувається інактивація ферментної системи вірусу, що знижує реплікацію вірусу.
Відомий спосіб інактивації вірусів -опроміненням [5].
Відомий спосіб інактивації вірусів за допомогою фенолу. До білкового розчину додають фенол концентрації менше 1 г/100 мл розчину і витримують приблизно 24 год [6].
Однак теплові способи інактивації не забезпечують повноцінної інактивації таких вірусних патогенів як вірус імунодефіциту людини (ВІЛ), гепатит В. Гамма-опромінення має інактивуючий вплив на функціонально активні та необхідні білкові компоненти плазмової фракції, а при використанніопромінення світлом можлива інактивація інших білкових компонентів плазми, до складу яких включаються іони Mg та Zn.
Використання хімічних препаратів для інактивації вірусів надалі вимагає повного видалення цих агентів, при цьому можуть бути інактивовані важливі білкові компоненти.
Відомий спосіб інактивації вірусних та бактеріальних патогенів у плазмі та сироватці крові обробкою її прогріванням при +80 o C протягом 30 хв, так як більшість видів вірусів інактивується при 56-60 o C протягом 5 - 30 хв [1, прототип].
Теплова обробка плазми крові не призводить до повної інактивації вірусних та бактеріальних патогенів у плазмі, а також відбувається інактивація важливих білків плазми крові.
Завданням винаходу є інактивація модельних вірусних патогенів у препаратах плазми крові без порушення функціональних властивостей білкових молекул, що входять до неї, зокрема фракції специфічних імуноглобулінів.
Поставлене завдання вирішується тим, що в способі інактивації ВІЛ та інших вірусів у плазмі крові людини шляхом впливу на них фізичними факторами, що включають температурну обробку, згідно винаходу як фізичні фактори додатково використовують підвищений гідростатичний тиск до 2500 атм одночасно з температурним впливом, причому температурний вплив проводять шляхом охолодження плазми до (-15) - (-20) o C.
Істотною ознакою винаходу є: - обробка плазми крові підвищеним гідростатичним тиском до 2500 атм і охолодження до (-15) - (-20) o C.
Даний спосіб інактивації ВІЛ та інших вірусів у плазмі крові людини зі збереженням функціональної активності білків плазми крові не відомий з літературних джерел, що свідчить провідповідно винаходу критерію "новизна" і "винахідницький рівень".
Далі слідує приклад конкретного виконання винаходу.
Два модельні віруси: вірус імунодефіциту людини (ВІЛ-1) та кору вирощують за звичайною методикою на культурах пермесивних клітин (лімфобластоїдні клітини людини МТ-4 та фібробласти японських перепелів, відповідно), визначають їх вихідну інфекційність, після чого в стерильних умовах розливають вірусну сус , або 0,5 мл плазми крові людини, що містить анти-ВІЛ імуноглобуліни, або в культуральне середовище RPMI-1640 і поміщають в стерильні пластикові пробірки об'ємом 0,6 мл. Пластикові пробірки поміщають в камеру високого тиску, яка являє собою циліндр з пробками, що загвинчуються, і з електровводами для вимірювання тиску, контролю температури і термоелементом для її підтримки в заданому режимі. Порожнина камери високого тиску заповнена силіконовим маслом, яке безконтактно передає тиск дослідним зразком, що створюється в камері ручним способом.
Охолодження зразків у камері досягається подачею через проточну систему камери за допомогою рідкого азоту, який охолоджує зразки до заданої температури (-15) - (-20) o C.
Зразки, що знаходяться в камері з вірусом, витримують протягом 30 хв за заданих умов, після чого їх підігрівають до кімнатної температури включенням термоелемента і поступово в режимі 50 атм/хв скидається гідростатичний тиск до атмосферного. Зазначена послідовність операцій необхідна для запобігання замерзанню зразків, оскільки, у разі скидання тиску до атмосферного рівня без попереднього підвищення температури зразків до кімнатної температури, водний розчин може піддатися замерзанню при негативній (нижче 0 oC) температурі. Облік результатів проводиться до і після впливу вищевказаних умов - з титрування інфекційності вірусів ВІЛ-1 і кору на чутливих до цитопатичної дії цих вірусів клітинах: клітини МТ-4 і Vero, відповідно, з оцінкою життєздатності клітин з фарбування 0,4% розчином тріпанового синього і наступним підрахунком живих і мертвих клітин у камері Горяєва за звичайною методикою, а також тестування специфічних вірусних антигенів методами ELISA і РТГА, для ВІЛ-1 і вірусу кору, відповідно. Специфічні анти-ВІЛ імуноглобуліни у зразках з плазмою крові аналізують методом ELISA (Rapid" Elavia Anti-HIV, Diagnostics Pasteur, Франція) за звичайною методикою шляхом дворазового раститровування зразків до кінцевого розведення, за титр зразка приймають те розведення, яке перевищувало ОПкрит. щільність визначається спектрофотометрі типу Multiskan, Labsystem (Фінляндія) при довжині хвилі 492 нм.
У таблиці наведено експериментальні дані щодо конкретного виконання заявленого винаходу.
Аналіз таблиці показує переваги запропонованого способу порівняно з відомим: при відомому способі (прогрівання при 60 o C) не відбувається повна інактивація тестованих вірусів (ВІЛ-1 та вірус кору) і при цьому відбувається часткова інактивація функціонально важливих білків плазми крові - специфічних імуноглобулінів ( титр антитіл після обробки у вищевказаних умовах 1: 250), з іншого боку при стерилізації радіаційною обробкою (-опроміненням) одночасно з інактивацією вірусних та бактеріальних патогенів йде інактивація функціональної активності сироваткових білків. При використанні цього винаходу відбувається інактивація модельних вірусних патогенів у препаратах плазми без порушенняфункціональних властивостей білкових молекул, що входять до неї, зокрема фракції специфічних імуноглобулінів.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ 1. Земсков М.В., Соколов М.І., Земсков В.М. Основи загальної мікробіології, вірусології та імунології, М., Колос, 1972, с. 117.
2. Міжнародна заявка N 91/01138 "Багатостадійний спосіб теплової обробки факторів зсідання крові". Опубліковано РЖ ІСМ 1-8-92.
3. Патент Україна N2079552 "Спосіб інактивації вірусу Ебола". Опубліковано БІ 14,97.
4. Патент Україна N2097427 "Спосіб інактивації вірусу СНІДу". Опубліковано БІ 33,97.
5. Catalog JRH Bioscinces. Fetal Bovine Serum Gamma Irradiated, 1998.
6. Європейська заявка N0281978 "Інактивування вірусу СНІД у розчинах, що містять білок, за допомогою фенолу". Опубліковано РЖ ІСМ 44-65-89.
ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
Спосіб інактивації ВІЛ та інших вірусів у плазмі крові людини шляхом впливу на них фізичними факторами, що включають температурну обробку, що відрізняється тим, що як фізичні фактори додатково використовують підвищений гідростатичний тиск до 2500 атм одночасно з температурним впливом, причому температурний вплив проводять шляхом охолодження плазми крові до (-15) - (-20) o C.