Спосіб отримання фолікулостимулюючого гормону, Банк патентів
Винахід відноситься до ветеринарії, зокрема способів отримання гормональних препаратів. При очищенні кінцевого продукту, отриманого з гомогенезованого гіпофіза свиней здійснюють іонообмінну хроматографію та гелеву фільтрацію у присутності катіонообмінника СМ-сефадекса при pH середовища 5,6 - 5,7. Одиниця маси кінцевого продукту за специфічною активністю еквівалентна активності ФСГ фірма Шерінг (США) у співвідношенні 1,20 - 1,25: 1. 2 табл.
ОПИС ВИНАХОДУ ДО ПАТЕНТУ
Винахід відноситься до ветеринарії, зокрема способів отримання гормональних препаратів.
Відомий спосіб отримання білкового гідролізату з тканин ендокринних залоз тварин шляхом кислотного гідролізу білків, екстрагування ацетоном, сумішшю хлороформ:спирт 2:1. Отриманий концентрат обробляють соляною кислотою, гідролізують, пропускають через іонообмінну смолу і висушують (авт.св. N 825083, кл. А 61 К 37/02, 1981).
Відомий також спосіб отримання білків із сировини тваринного походження, що включає екстракцію білків із сировини сумішшю хлороформу з метанолом, промивання екстракту перерозчинення та осадження. Промивання екстракту здійснюють 0,09-0,10-процентним розчином хлористого натрію. Перерозчиняють білки органічними розчинниками. Осідають ацетоном при співвідношенні розчинника і ацетону 1: 5-1: 10 протягом 1-2 год (авт.св. N 1080825, кл. А 61 До 37/22, 1984).
Однак відомі способи вилучення білків з тканин тварин не можуть бути використані при отриманні фолікулостимулюючого гормону з гіпофіза вбитих тварин, оскільки в екстракті присутні не менше дев'яти гормонів, що контролюють трофіку інших залоз, наприклад АКТГ, ТТГ, ЛГ та ін. (Дж. Бакл, Гормони тварин, М. "Світ",1986, с. 9.27).
Виділення кожного з гормонів потребує певного індивідуального способу, оскільки вони відрізняються своїми специфічними особливостями та різною молекулярною масою. Для суперовуляції самок великої рогатої худоби найбільше значення має фолікулостимулюючий гормон (ФСГ), що є глюкопротеїдом, має біохімічні та імунологічні властивості, що відрізняються від властивостей гонадотропіну, отриманого з крові лошат кобил (СЖК). ФСГ не має статевої специфічності, стимулює дозрівання та зростання фолікулів у яєчниках самок сільськогосподарських тварин, утворення фолікулярної рідини та при спільній дії з лютеїнізуючим гормоном сприяє утворенню естрогенів в організмі тварин. Використовується при лікуванні гіпофункції корів і телиць для викликання овуляції у самок-донорів за технологією отримання ембріонів. У насінниках самців-виробників ФСГ стимулює розвиток спермогенних канальців та початкову стадію сперматогенезу, але не впливає на гормональну активність насінників сільськогосподарських тварин (Ветеринарна енциклопедія. М. "Радянська енциклопедія", 1976, с. 302).
Як видно з вищенаведеного, ФСГ може бути широко та продуктивно використаний у тваринництві та ветеринарії. Однак виділення його з гіпофіза за допомогою витяжки органічними розчинниками за відомими способами є складним, дорогим процесом, а кінцевий продукт (ФСГ), як правило, низькоактивним. Доводиться закуповувати його в іноземних фірм.
Мета винаходу-підвищення ефективності цільового продукту.
Поставлена мета досягається тим, що при очищенні гормонального препарату здійснюють іонообмінну хроматографію та гелеву фільтрацію в присутності катіонообмінника СМ-сефадекса при рН-середовищі, що дорівнює 5,6-5,7.
Катіонообмінник СМ-сефадекс (карбоксиметилсефадекс) застосовується при поділі та фракціювання основних білків (Н.Кацимпулас. Іонообмінна хроматографія. У кн. Хроматографія. Практичне застосування методу. М. "Мир", 1986, с. 109). У доступній нам науково-технічній літературі використання СМ-сефадексу при очищенні ФСГ методом іонообмінної хроматографії та гелевої фільтрації з рН-середовищем, що дорівнює 5,6-5,7 не встановлено. Саме ці суттєві ознаки нового способу з дворазовою обробкою СМ-сефадексом (на початку гелем, а потім порошкоподібним) гормонального препарату, одержаного з гіпофізу свиней, дозволяють значно підвищити специфічну активність та ефективність використання цільового продукту, білоукраїнського ФСГ у ветеринарії.
П р і м е р (конкретне виконання способу). Свіжозаморожений гіпофіз свиней гомогенізують, навішування в 200 г поміщають в колбу ємністю 1500 мл, заливають екстрагуючою сумішшю, що складається з 10%-ного ацетату натрію або ацетату амонію на 60% і 96%-процентного етилового спирту до 5,7. Екстрагують у холодильнику при 0-5 про С протягом 12-15 год з використанням магнітної мішалки. Потім центрифугують центрифуги при 5000 об/хв. Зливають супернатант та вимірюють його обсяг. До осаду додають 50 об'єму тієї ж суміші, що естрагує, струшують і тим же способом екстрагують ще 2 год і також центрифугують. Супернатанти об'єднують, перемішують та визначають загальний обсяг витяжки, до якого додають 4,6 л 83-відсоткового етилового спирту. Відпрацьований осад викидають. Осадження ФСГ проводять у морозильній камері при -18 про С протягом 12-15 год, після чого прозору верхню частину суміші зливають, а нижню центрифугують вищеописаним способом і знову відбирають світлу фракцію розчину. Опадобробляють 4-мілімолярним розчином ацетату натрієвого буфера на бидистиллированной воді з рН 5,7. Об'єм розчину доводять до 500 мл. Дворазове розчинення осаду здійснюють у скляній склянці в холодильнику при температурі 0-5 про С протягом 1-2 год з використанням магнітної мішалки, після чого знову центрифугують вищеописаним способом протягом 15 хв. Супернатанти змішують і додають до заздалегідь приготовленого гелю із СМ-сефадекса. Готують його наступним чином: 10 г порошкоподібного СМ-сефадексу заливають (500 мл) ацетатним 4-мілімолярним буфером. Дозрівання гелю триває 30 хв. Після цього надлишки рідини зливають.
Супернатанти в гелі ретельно перемішують скляною паличкою з наступним струшуванням і змішуванням на магнітній мішалці протягом 2 годин при температурі навколишнього середовища 0-5 про С. Потім розчин фільтрують через Зейтцевий фільтр або через колонку з гель-фільтратом при тій же температурі. До отриманого фільтрату повторно додають 1 г СМ-сефадекса, але вже в сухому порошкоподібному вигляді перемішують і таким же способом ще раз фільтрують. Відбирають 500 мл фільтрату, додають 1 млн. од. тетрацикліну для ін'єкцій і ліофілізують до порошкоподібного стану, приблизно 48 год, в алюмінієвих піддонах при температурі 0 про С. Кінцевий продукт являє собою сухий аморфний порошкоподібний субстант біло-сірого або сіро-жовтого кольору, розчинні в дистильованій воді або фізрозчині. ФСГ розфасовують у 10-мілілітрові флакони по 150 мг, закупорюють та маркують. Зберігають ФСГ при температурі 2-4 про З. Термін придатності препарату 2 роки.
Одночасно проводили ще два досвіди щодо отримання білоукраїнського ФСГ за вищеописаною методикою, але за різного рН-середовища: 5,5 та 5,9. Всі інші параметри та послідовність дій способу булианалогічними, як і вищеописаному прикладі конкретного виконання способу.
Специфічну активність одержання препаратів визначали біологічним методом і здатності стимулювати зростання яєчників у інфантильних самок на фоні введення надлишку гонадотропіну хоріогонічного (хоріогонін) при порівняльному впливі ФСГ із свідомо відомою активністю виробництва фірми Шерінг (США) на аналогічних тварин. Препарати вводили підшкірно протягом 4 діб, двічі на день. Контролем служили тварини, які отримували ін'єкцію фізрозчину, і стільки ж тварин, які отримували по 40 ІЕ хоріогоніну, оскільки всі досвідчені тварини перед введенням різних доз ФСГ оброблялися такою ж (40 ІЕ) кількістю хоріогоніну. Початковою дозою ФСГ було 0,25 мг, потім 0,5 та 1,0 мг. Четверта група тварин отримувала додаткову дозу ФСГ, отриманого в середовищі з рН, що дорівнює 5,5, 5,7 та 5,9, для встановлення еквівалентної маси білоукраїнського ФСГ Iму мг ФСГ фірми Шерінг за специфічною активністю.
Результати досліджень наведено у табл.1. Дані свідчать, що специфічна активність отриманих гормональних препаратів трохи поступалася активності імпортного ФСГ фірми Шерінг із США. На одну одиницю маси імпортного ФСГ припадало 1,20-1,25 мас-одиниці білоукраїнського ФСГ. Більш активним був ФСГ, отриманий у середовищі з рН 5,7, порівняно з ФСГ, отриманим у середовищі з рН 5,5 та 5,9 (71,8 ± 7,3 проти 69,4 ± 7,2 та 68, 6±7,0).
Порівняльна оцінка ефективності використання у ветеринарії для викликання суперовуляції у самок великої рогатої худоби була здійснена на тваринницькій фермі конезаводу "Заріччя" Смолевичського району Мінської області. За випробуваною технологією виробництва ембріонів 39 корів було опрацьовано білоукраїнським ФСГ. Контролем служила групааналогічних тварин, оброблених такою самою дозою ФСГ виробництва фірми Шерінг (табл.2).
Гормональна обробка корів-донорів проводилася за стандартною чотириденною схемою ін'єкцій ФСГ у дозі 1200 ІЄ ФСГ білоукраїнського виробництва, отриманого в середовищі з рН 5,7 та виробництва фірми Шерінг.
Таким чином, специфічна активність ФСГ, виготовленого за пропонованим способом з використанням середовища при рН 5,7 дещо перевищує аналогічний показник ФСГ, отриманий серед рН 5,5 і 5,9. Використовуючи новий спосіб отримання білоукраїнського ФСГ, можна обійтися без дефіцитного, дорогого імпортного гормонального препарату, за який тепер доводиться платити валютою.
ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
СПОСІБ ОТРИМАННЯ ФОЛІКУЛОСТИМУЛЮЮЧОГО ГОРМОНУ з гіпофіза тварин, що включає подрібнення сировини і екстрагування, який відрізняється тим, що екстрагування здійснюють у суміші 10%-ного розчину ацетату натрію або ацетату амонію і 96%-ного етилового спирту протягом 12 - 15 год при температурі 0 - 5 o С, суміш центрифугують і обробляють етиловим спиртом, осад відкидають, осадження цільового продукту проводять при температурі -18 o С протягом 12 - 15 год осад очищають за допомогою СМ-сефадекс двічі: гелем і порошком, при цьому гель готують змішуванням порошкоподібного сефадекса з 4-мілімолярним буфером ацетату натрію або ацетату амонію у співвідношенні 1 : 50 і витримують протягом 2 год з продуктом, що очищається при температурі 0 - 5 o С, фільтрують, до про мл порошкоподібного сефадекса, перемішують протягом 1 години, знову фільтрують і ліофільно висушують.