Спосіб отримання полігемоглобіну з підвищеною кисневотранспортною ефективністю - патент РФ
Спосіб включає взаємодію дезоксигемоглобіну з біфункціональним зшиваючим агентом у буферному розчині з рН 6,8 - 7,4 при мольному відношенні гемоглобін : зшиваючий агент = 1 : (4 - 24). Реакція завершується додаванням речовини, що закриває функціональні групи зшивача, що залишилися. Як зшивач використовують глутаровий альдегід, модифікований речовиною з ряду, що містить дикарбонову амінокислоту (наприклад, аспарагінову, глутамінову) і бісульфіт натрію. Модифікацію взаємодіють 0,1 - 5,0 мас. % розчинів глутарового альдегіду і модифікатора та при їх молярному відношенні 1: 0,2 - 1,2. Спосіб дозволяє проводити модифікацію не вихідного гемоглобіну, як це реалізовано всіма відомими методами, а агента, що зшиває - глутарового альдегіду. 1 з.п.ф-ли, 3 табл.
Малюнки до патенту Україна 2132687
Винахід відноситься до отримання полігемоглобіну, який може уявити основу кровозамінних розчинів з функцією перенесення кисню.
Винахід може бути використаний для виробництва кровозамінних розчинів, порівнянних ефективності газового транспорту (перенесення кисню) з еритроцитами крові людини.
Відомий спосіб отримання полігемоглобіну з підвищеною кисневотранспортною ефективністю /1/, який реалізується наступною сукупністю суттєвих ознак: I стадія.
1. Модифікація гемоглобіну (Гб). До 18 мас.% розчину Гб донорської крові в 0,1 М трис-буфері з pH 7,4 додають 0,2 мас.% глюкози, 0,2 мас.% глутатіону та 0,05 мас.% аскорбінової кислоти.
2. Потім розчин додають пиридоксаль-5-фосфат (ПФ) в молярному відношенні ПФ:Гб = 4 : 1.
3. Розчин дезоксигенують продуванням азотомі додають боргідрид натрію.
4. Полімеризація. До водного буферного розчину, що містить 16 мас.% Гб, модифікованого піридоксаль-5-фосфатом, додають 0,15 мас.% глутатіону і 0,29 мас.% лізину.
5. Розчин охолоджують до +5 o C і при цій температурі при перемішуванні додають 10 - 15 мас.% водний розчин глутарового альдегіду (ГА), масове співвідношення ГА: Гб = 1: 4 - 5.
6. Реакцію завершують додаванням водного розчину лізину.
Основною характеристикою отриманого модифікованого полігемоглобіну (ПГб) є величина напівнасичення киснем (P50), яку порівнюють з P50 для вихідного Гб.
У табл. 1 (див. наприкінці опису) наведено порівняльні величини P50 для модифікованого ПГб і вихідного Гб, отриманих у відомих умовах.
Основним недоліком відомого способу є використання модифікації Гб дорогого біологічно активного реагенту - пиридоксаль-5-фосфату. ПФ вводять у реакційну суміш у надлишкових кількостях, а потім видаляють із цільового продукту, оскільки вільний ПФ може виявляти небажані наслідки.
Завданням пропонованого винаходу було створення способу отримання ПГб з підвищеною кисневою транспортною ефективністю з використанням більш технологічного модифікатора, що не володіє значною біологічною активністю. Це завдання було вирішено заявленим способом отримання полігемоглобіну з підвищеною кисневотранспортною ефективністю, який реалізується сукупністю наступних суттєвих ознак: I стадія.
1. Модифікація глутарового альдегіду. ГА модифікують дією модифікатора у водному буферному розчині при pH 6,8 - 7,4 і при концентраціях ГА і модифікатора 0,1 - 5,0 мас.%, мольне співвідношення ГА модифікатор = 1 : 0,2 - 1,2.
2. В якості модифікатора беруть речовину з ряду, що включає амінокислоти дикарбонові (наприклад, аспарагінову, глутамінову) і бісульфіт натрію.
3. Полімеризація. 1 - 10 мас.% водний розчин Гб донорської крові дезоксигенируют і при 4 o - 24 o C додають 1 - 5 мас.% водний розчин модифікованого глутарового альдегіду при молярному відношенні Гб: пов'язаний модифікуючий агент = 1: 4 - 24.
4. Реакцію завершують додаванням водного розчину натрію боргідриду.
У виділеному цільовому продукті методом гельпроникаючої хроматографії визначають ММР (молекулярно-масовий розподіл) та оцінюють СММ, а також визначають величину P50 з кривих дисоціації оксигемоглобіну.
Відмінними від способу-прототипу ознаками є ознаки 1 – 3.
Аналіз відомого рівня техніки не дозволив виявити рішення, що повністю збігається за сукупністю суттєвих ознак із заявленим способом. Це підтверджує новизну речення.
Аналіз відомого рівня науки і техніки не дозволив виявити якісь рішення, які використовують зазначені відмітні ознаки. Новизна відмітних ознак свідчить про наявність вперше виявленої функціональної залежності "структура - властивість", що підтверджує відповідність рішення умові патентоспроможності "винахідницький рівень". Дійсно, всі раніше відомі способи отримання ПГБ з підвищеною киснево-транспортною ефективністю ґрунтувалися на модифікації вихідного ГБ. У заявленому способі ефект досягнутий за рахунок модифікації агента, що зшиває - глутарового альдегіду.
За каталогом реактивів "Sigma", Chemical Company, 1994, "Biochemical Organic Compounds for Research and Diagnostic reagents" /5/ 1 г пірпідоксал-5-форсфату коштує 12,1 доларів США, 500 г глутаміновоїкислоти (99% чистоти) – 11 доларів.
Гемоглобін одержують осмотичним гемолізом відмитих еритроцитів донорської крові /6/. Концентрацію нативного Гб та продуктів його хімічної модифікації визначають спектрофотометрично за ціанметгемоглобіновим виробництвом при довжині хвилі = 540 нм /7/. Використовують 25% водний розчин глутарового альдегіду фірми Реанал (Угорщина), очищений активованим вугіллям. Концентрацію ГА визначають методом диференціальної рН-метрії з гідроксиламіном /8/. Бісульфіт натрію (NaHSO3) одержують безпосередньо перед використанням /9/. Його концентрацію визначають йодометрично. Концентрацію амінокислот визначають за реакцією з 2,4,6-тринітробензолсульфокислотою /10/.
Криві дисоціації оксигемоглобіну отримують на реєструвальному приладі "Гем-О-ксан" (фірма Amico, US) у стандартних умовах (pH 7,4; 37 o C) в діапазоні парціальних тисків кисню від 0 до 180 торр, що досягаються продуванням азоту або суміші азот - кисень (75: 25 v/v) без додавання CO2. На підставі кривих дисоціації оксигемоглобіну визначають величину напівнасичення Гб киснем (P50). Всі проби Гб і модифікованого ПГб попередньо диалізують проти 0,05 М трис-HCl буфера з 0,15 M NaCl, pH 7,4. Похибка у визначенні P50 становить 10 – 15%. Розкид даних P50 залежить, насамперед, від повноти видалення 2,3-дифосфоглицерата з розчину вихідного Гб, часу зберігання Гб, ступеня його автоокислення (змісту метформи), а також відображає статистичний характер процесу модифікації молекули Гб при її зшиванні. У кожному випадку величина P50 цільового ПГб порівнюється з величиною P50 вихідного Гб.
Для підтвердження відповідності заявленого способу умові "промислова застосовність" та для кращого розуміння сутності пропозиції наводимо приклади конкретноїреалізації винаходу.
Приклад 1. Отримання модифікованого ПГБ в умовах способу - прототипу: модифікація Гб піридоксал-5-фосфатом і зшивання глутаровим альдегідом.
20 мл 5 мас.% водного розчину Гб з донорської крові з pH 7,0 продують азотом при 10 o C до переходу Гб дезоксиформу. Потім при перемішуванні розчину в струмі азоту додають 1,6 мл 1 мас.% водного розчину піридоксаль-5-фосфату в 0,1 М трисбуфер з pH 7,0. Після перемішування протягом 1 години при 10 o C додають 0,25 мл 0,1 мас.% водного розчину натрію боргідриду з pH 8,0. До водного розчину модифікованого Гб при 10 o C струмі азоту додають 2,5 мл водного 2 мас.% розчину глутарового альдегіду. Реакцію проводять протягом 1 години і завершують введенням реакційну суміш 1 мл 0,1 мас.% розчину боргідриду натрію з pH 8,0.
Отриманий піридоксильований ПГБ виділяють гельхроматографічно. Вихід на Гб 100%. Зміст піридоксаль-5-фосфатних груп та інші характеристики представлені у табл. 2 (див. наприкінці опису) Приклади 1 - 5 проведені в ідентичних умовах.
Приклад 6. Отримання ПГб шляхом зшивання Гб глутаровим альдегідом, модифікованим глутамінової кислоти.
40 мл водного розчину Гб донорської крові з концентрацією 5,0 мас.% з pH 7,0 поміщають в колбу ємністю 200 мл і проводять дезоксигенацію в струмі азоту при перемішуванні при 12 o C. До дезоксигенованого розчину Гб прикопують 3,1 мл водного розчину з концентрацією 2 мас.% ГА і 1,47 мас.% глутамінової кислоти в 0,1 М фосфатному буферному розчині з pH 7,0. Реакцію ведуть при перемішуванні протягом 1 години, потім додають 52,4 мл 1 мас.% водного розчину боргідриду натрій з pH 9,0. Перемішують ще 30 хв. Відбирають 1 мл реакційної суміші, проводять діаліз проти 2 л 0,05 М розчину трис-буфера з рН7,4, що містить 0,15 М NaCl протягом доби. У підготовленій таким чином пробі вимірюють криву дисоціацію оксигемоглобіну. Для порівняння вимірюють криву дисоціації оксигемоглобіну у вихідному розчині Гб, що віддіалізується в тих же умовах. Для цільового продукту P50 23 торр, вихідного Гб 15 торр. ММ ( ) для цільового продукту становить 2,3 10 5 Д.
Приклади 7 - 11 виконані в умовах прикладу N 6 всі дані за прикладами 6 - 11 представлені в табл. 3 (див. наприкінці опису).
Приклад 12. Отримання ПГб шляхом зшивки Гб глутаровим альдегідом, модифікованим бісульфітом натрію.
У колбу на 51 мл вміщують 10 мл водного розчину Гб з концентрацією 4,7 мас. % з pH 7,0 і проводять дезоксигенацію Гб продуванням азоту при 12 o C. До розчину дезоксигенованого Гб при тій же температурі і при перемішуванні додають 0,84 мл фізіологічного розчину з концентрацією по ГА 1,74 мас.% і бісульфіту натрію 0 ,73 мас.%. Суміш перемішують 1:00. Реакцію зупиняють додаванням 0,5 мл 1,0 мас.% водного розчину боридриду натрію pH 8,5 з наступним перемішуванням протягом 30 хвилин. В умовах прикладу 1 виділяють цільовий продукт та проводять його характеристику.
Приклади 13 і 14 виконані в умовах прикладу 12. Усі дані за прикладами 12 - 14 представлені в таблиці 3.
Аналіз наведених прикладів показує, що завдання вирішена. Отримано модифікований ПГБ із збереженням водорозчинності та високою кисневотранспортною ефективністю. При цьому модифікацію проводять не вихідного Гб, як це реалізовано всіма відомими способами, а агента, що зшиває - глутарового альдегіду. Як модифікатори використовують істотно більш технологічні речовини з ряду, що включає дикарбонові амінокислоти і бісульфіт натрію.
Сутністьзаявленого винаходу не вичерпується тільки наведеними прикладами з конкретними дикарбоновими амінокислотами та бісульфатом натрію як модифікатори. Очікується, що ефективними виявляться й інші дикарбонові амінокислоти, а також ді- і полікарбонові пептиди при їх використанні як модифікатори агентів, що зшивають.
Можна вказати, що додатковою перевагою заявленого способу є підвищений ефект модифікації: у таблиці 3 показано, що співвідношення P50 ПГб/P50 Гб дорівнює 1,35 - 2,25, а таблиці 2 ті ж співвідношення для ПГб, отриманого в умовах способу-прототипу , Не перевищують 1,07 - 1,55.
Джерел інформації 1. L. R. Sehgal, A. L. Rosen, S. A. Gould, H.L. Sehgal, G.S. Moss/Transfusion. – 1983. – v. 23. – N 2. – P. 158-162.
2. F. De-Venuto / Biomaterials Artificial Cells and Artificial Organ. – 1988. – v. 16. - N 1-3. – P. 77-83.
3. L.R. Sehgal, H.L. Sehgal, A.L. Rosen, S.A. Gould, R. De-Woskin, G.S. Moss/ibid. – P. 173-183.
4. P.E. Keipert, T.M. Chang/ibid. – P. 185-196.
5. Biochemical Organic Compounds for Research and Diagnostic reagents, Sigma, Chem. Company, 1994.
6. S.E. Rabiner/J. Exp. Med. - 1967 – v. 126. – N 6. – P. 1127-1132.
7. М. С. Кушаковський / Клінічні форми пошкодження гемоглобіну. Л.: Медицина. – 1968. – С. 23.
8. H. R. Roe, G. Mitchel/Analyt. Chem. - 1951 – v. 23. – N 12. – P. 1758-1760.
9. Ю. В. Карякін, І.І. Ангелов / Чисті хімічні реактиви, М: ГНТІ, хім. л-ра. – 1955. – С. 397-398.
10. R. Fields/Biochem. J. – 1971. – v. 124. – P. 581-590.
11. Н.П. Кузнєцова, Г.В. Самсонов / Високомолекул. з'єднання. – 1985. – сірий. А. – т. 27. – N 12. – С. 2611 – 2614.
ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосібодержання полігемоглобіну з підвищеною кисневою транспортною ефективністю шляхом взаємодії дезоксигенованого гемоглобіну з глутаровим альдегідом у буферному розчині з попередньою модифікацією одного з взаємодіючих компонентів і з завершенням реакції додаванням речовини, що закриває функціональні групи зшивача, що відрізняється тим, що глутаровий альдегід - 7,4 при концентрації альдегіду і модифікатора 0,1 - 5,0 мас.% і при молярному співвідношенні глутаровий альдегід : модифікатор, що дорівнює 1:(0,2 - 1,2), а взаємодія дезоксигенованого гемоглобіну з модифікованим глутаровим альдегідом при мольному відношенні гемоглобін: пов'язаний модифікуючий агент 1: (5 - 24).
2. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що в якості модифікатора використовують речовину з ряду, що включає амінокислоту дикарбонову (наприклад, аспарагінову, глутамінову) і бісульфіт натрію.