Спосіб виявлення слідів гемоглобіну у зразку - патент Україна 2132643 - Маяцька М
Винахід відноситься до галузі медицини, зокрема до криміналістики. Спосіб характеризується тим, що для наявності слідів крові (гемоглобіну) на речових доказах здійснюють вимірювання активності хемолюмінесценції проби досліджуваного зразка. При виявленні в ній наявності вмісту пероксидазо-активних речовин за еталонною калібрувальною кривою, попередньо отриманої для відомих кількостей гемоглобіну, пробу досліджуваного зразка у разі необхідності піддають взаємодії з сорбентом, селективним по відношенню до гемоглобіну та рослинної пероксидази. Відокремлюють її від сорбенту промиванням водою, проводять вимірювання активності хемолюмінесценції її водного змиву і за відсутністю хемолюмінесценції судять про наявність гемоглобіну. При цьому вимірюють активність хемолюмінесценції, що протікає при окисленні пероксидом водню в присутності пероксидазо-активних речовин люмінолу у водному розчині гідроксиду натрію, що містить етилендіамінтетраоцтову кислоту або її сіль натрієву. В якості сорбенту, селективного по відношенню до гемоглобіну та рослинної пероксидази, використовують DEAE Sephadex A-50 або Sephadex G-50-medium. Спосіб забезпечує підвищення точності визначення. 2 з.п.ф-ли, 3 іл.
Малюнки до патенту Україна 2132643
Винахід відноситься до способів виявлення слідів пероксидазо-активних речовин і може знайти застосування в криміналістиці та судовій медицині, зокрема, для наявності крові на речових доказах.
Відомі способи виявлення слідів пероксидазо-активних речовин (гемоглобіну) у зразку у вигляді водного розчину шляхом вимірювання зміни забарвлення протікає при окисленні пероксидом у присутності пероксидазо-активної речовини(гемоглобіну) хромогену (гвояковий заступник) (Патент Великобританії 2147416, кл. G 01 N 21/78, 1985 р.) або фенілендіаміну і нафтолу (патент США 5182213, кл. G 01 N 39/3.
Недоліком відомих способів є обмеження їхньої чутливості в межах до 110 -6 г/л, а також тривалість вимірювання зміни забарвлення (близько 60 хв).
Відомий також спосіб виявлення слідів пероксидазо-активних речовин у зразку вимірюванням хемолюмінесценції, що протікає при окисленні пероксидом у присутності пероксидазо-активних речовин гідразиду заміщеної амінофталевої кислоти (гідразид 7-диметиламінофталевої кислоти) в розчині буфера з кал містить депресор металів (етилендіамінтетраоцтова кислота (EDTA) або її натрієва сіль), і визначенням вмісту пероксидазо-активних речовин за еталонною калібрувальною кривою (патент США 4302537, кл. G 01 N 31/14, 1981).
Недоліком відомого способу є неможливість точного встановлення наявності слідів крові (гемоглобіну) на речових доказах, пов'язана з тим, що відомий спосіб не дає можливість точно визначити, яка саме пероксидазоактивна речовина викликає хемолюмінесценцію.
Завдання досягається тим, що у відомому способі виявлення слідів пероксидазо-активних речовин у зразку вимірюванням активності хемолюмінесценції, що протікає при окисленні перекисним з'єднанням у присутності пероксидазо-активних речовин гідразиду заміщеної амінофталевої кислоти в розчині буфера з pH 6-9, вмісту пероксидазо-активних речовин за еталонною калібрувальною кривою, здійснюють вимірювання активності хемолюмінесценції проби досліджуваного зразка та при виявленні в ній наявності вмісту- пероксидазо-активних речовин за еталонною калібрувальною кривою, попередньо отриманої для відомих кількостей гемоглобіну, пробу досліджуваного зразка піддають взаємодії з сорбентом, селективним по відношенню до гемоглобіну і рослинної пероксидази, відокремлюють її від сорбенту промиванням водою, проводять вимірювання відсутність хемолюмінесценції судять про наявність гемоглобіну.
При цьому вимірюють активність хемолюмінесценції, що протікає при окисленні пероксидом водню в присутності пероксидазо-активних речовин люмінолу у водному розчині гідроксиду натрію, що містить етилендіамінтетраоцтову кислоту або її сіль натрієву. Крім того, як сорбент, селективний по відношенню до гемоглобіну і рослинної пероксидази, використовують DEAE Sephadex А-50 або Sephadex G-50-medium. Перевага запропонованого способу полягає в тому, що в ньому виключено вплив інших пероксидазо-активних речовин, крім гемоглобіну на кінцевий результат визначення, і тим самим підвищена точність встановлення наявності крові на речових доказах. Використання запропонованого способу дозволяє з високою чутливістю (до 10 -10 г/л гемоглобіну) визначати наявність слідів крові на речових доказах.
На фіг. 1 наведена еталонна калібрувальна крива.
Сутність запропонованого способу полягає в наступному.
Досліджуваний зразок (вирізка матеріалу або змив із плям речових доказів) заливається фізіологічним розчином і залишається при 4 - 12 o C (в умовах побутового холодильника) протягом 12 - 18 год.
Готується реакційна суміш з буфера - водного розчину гідроксиду натрію (NaOH), люмінолу, пероксиду водню (H2O2) та ЕДТА або її натрієвої солі (Na2ЕДТА) при наступномувміст - компонентів: NaOH -4 - 1010 -3 г/моль, люмінол -2,5 - 4,510 -6 г/моль, (H2O2)-2,5 - 4,510 -6 г/млль, ЕДТА (Na2ЕДТА)-0, 3 – 0,5г/моль.
На підставі отриманих даних будується еталонна калібрувальна крива, наведена на фіг. 1, в білогарифмічній системі координат, де по осі абсцис відкладається lg вмісту гемоглобіну, а по осі ординат - світлосуми lg хемолюмінесценції.
Після витримування досліджуваного зразка у фізіологічному розчині, як описано вище, береться його проба і в неї вводиться реакційна суміш і вимірюється світлосума хемолюмінесценції за 15 - 30 при 420 нм на люмінометрі. Отримане значення світлосуми порівнюється з еталонною калібрувальною кривою. Якщо виміряна світлосума укладається в діапазон калібрування, що говорить про присутність у досліджуваній речовині пероксидазо-активних речовин, то проба досліджуваного зразка піддається взаємодії з сорбентом - DEAE Sephadex A-50 або Sephadex G-50-medium, селективним по відношенню до гемоглобіну. 5 – 10 хв. Потім проба досліджуваного зразка відокремлюється від сорбенту промиванням його дистильованою водою. Отриманий водний змив аналізується на люмінометрі, як описано вище, після введення в нього реакційної суміші. Якщо світлосума хемолюмінесценції при дослідженні водного змиву буде близькою або дорівнює нулю, можна доказово стверджувати про наявність слідів гемоглобіну в досліджуваному зразку. Якщо ж виміряна світлосума входитиме в діапазон калібрування, то в досліджуваному зразку присутня пероксидаза і висловитися про присутність крові неможливо.
Нижче наводяться приклади, що ілюструють запропонований спосіб.
У пробірку поміщають 1 мл реакційної суміші і вносять до неї 0,1 мл одного з калібрувальних розчинів гемоглобіну. Пробіркупоміщають в камеру люмінометра, підключеного до ЕОМ, та вимірюють світлосуму хемолюмінесценції за 15 с на довжині хвилі 420 нм при кімнатній температурі (20 o C). Аналогічні вимірювання проводять для всіх калібрувальних розчинів. За отриманими значеннями світлосуми ЕОМ будує еталонну калібрувальну криву, яка наведена на фіг. 1.
У пробірку поміщають 0,5 мл реакційної суміші і до неї вносять 0,1 мл проби досліджуваного зразка, після витримування його в холодильнику. Пробірку поміщають у камеру люмінометра та вимірюють світлосуму за 15 с на довжині хвилі 420 нм при кімнатній температурі (20 o C). Отримують значення світлосуми 167400, яке при порівнянні з еталонною кривою калібрувальної відповідає наявності 5010 -9 г/л пероксидазоактивного речовини в досліджуваному зразку.
У колонку поміщають 1 мл суспензії сорбенту DEAE Sephadex A-50, вносять до неї 0,1 мл проби досліджуваного зразка. Через 5 хв сорбент промивають 0,9 мл дистильованої води, тим самим відокремлюючи сорбент. Водний змив поміщають у пробірку, у нього вводять 0,5 мл реакційної суміші. Пробірку поміщають у люмінометр і вимірюють світлосуму як описано вище. Виміряна світлосума дорівнює 0. Це свідчить у тому, що у досліджуваному зразку є 5010 -9 г/л гемоглобіну, тобто. на речових доказах є кров.
Побудова еталонної калібрувальної кривої, наведеної на фіг. 2, здійснюють також як описано в прикладі 1. Пробу досліджуваного зразка готують і визначають в ній активність (світлосуму) хемолюмінесценції також як описано в прикладі 1. Отримують значення світлосуми 35200, яке при порівнянні з еталонною калібрувальною кривою відповідає наявності в досліді г/л пероксидазо-активної речовини.
Пробу досліджуваного зразка піддають взаємодії зсорбентом так само, як описано в прикладі 1. Потім проводять вимірювання світлосуми хемолюмінесценції водного змиву після введення в нього 0,5 мл реакційної суміші протягом 15 секунд. Виміряна світлосума становить 35000, що говорить про наявність у досліджуваному зразку пероксидази та свідчить про неможливість доказово стверджувати про присутність крові (гемоглобіну) на речових доказах.
Побудова еталонної калібрувальної кривої, наведеної на фіг. 3 здійснюють так само, як описано в прикладі 1. Пробу досліджуваного зразка готують і визначають в ній активність (світлосуму) хемолюмінесценції так само, як описано в прикладі 1. Отримують значення світлосуми 221340, яке при порівнянні з еталонною калібрувальною кривою відповідає наявності зразку 1010 -9 г/л пероксидазо-активної речовини.
Пробу досліджуваного зразка піддають взаємодії з сорбентом, відокремлюють її від сорбенту і проводять вимірювання світлосуми хемолюмінесценції водного змиву так само, як описано в прикладі 1. Виміряна світлосума становить 30 близька до нуля. Це свідчить у тому, що у досліджуваному зразку є 1010 -9 г/л гемоглобіну, тобто. на речових доказах є кров.
Приклад 4. Визначення наявності слідів гемоглобіну (крові) у досліджуваному зразку здійснюють так само, як описано в прикладі 1, за винятком того, що реакційна суміш замість Na2ЕДTA містить ту саму кількість ЕДТА.
Приклад 5. Визначення наявності слідів гемоглобіну (крові) у досліджуваному зразку здійснюють так само, як описано в прикладі 1, за винятком того, що як селективний сорбент використовують Sephadex G-50-medium.
ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
1. Спосіб виявлення слідів гемоглобіну у зразку шляхом вимірювання активності хемолюмінесценції,протекающей при окислении перекисным соединением в присутствии пероксидазо-активных веществ гидразида замещенной аминофталевой кислоты в растворе буфера с pH 6 - 9, содержащего депрессор металлов, определением наличия содержания пероксидазо-активных веществ по эталонной калибровочной кривой, отличающийся тем, что осуществляют измерение активности хемолюминесценции пробы исследуемого зразка і при виявленні в ній наявності вмісту пероксидазо-активних речовин за еталонною калібрувальною кривою, попередньо отриманої для відомих кількостей гемоглобіну, пробу досліджуваного зразка піддають взаємодії з сорбентом, селективним по відношенню до гемоглобіну і рослинної пероксидази, активності хемолюмінесценції її водного змиву та за відсутністю хемолюмінесценції судять про наявність гемоглобіну.
2. Спосіб за п.1, який відрізняється тим, що вимірюють активність хемолюмінесценції, що протікає при окисленні пероксидом водню в присутності пероксидазо-активних речовин люмінолу у водному розчині гідроксиду натрію, що містить етилендіамінтетраоцтову кислоту або її натрієву сіль.
3. Спосіб за п. 1 або 2, який відрізняється тим, що як сорбент, селективний по відношенню до гемоглобіну і рослинної пероксидази, використовують DEAE Sephadex А-50 або Sephadex G-50-medium.