Спосіб визначення білка в розчині

Винахід відноситься до біології, біотехнології та медицини, може бути використане в клініках і застосовуватися для визначення концентрації білка в автоматизованому режимі при біотехнологічних процесах, конкретно для солюбілізованих детергентами розчинів мембранних білків Мета винаходу - визначення білка в присутності ПАР при одночасному підвищенні точності способу в тому, що попередньо знімають спектри поглинання розчинів білка з поверхнево-активною речовиною і поверхнево-активної речовини при тій же концентрації в УФ-діапазоні довжин хвиль 200-260 нм. визначають дві довжини хвилі при яких помилка визначення концентрації білка мінімальна, і потім розраховують концентрацію досліджуваного білка. 1 табл

РЕСПУБЛІН (si)s G 01 N 33/68

ПО ВИНАХОДАМ І ВІДКРИТТЯМ

До СВІДОЦТВОМ (21) 4466719/14 (22) 25.07.88 (46) 15.06.91, Бюл. ¹ 22 (71) Науково-дослідний інститут фізико-хімічної медицини (72) В.Є.Третьяков, В.В.Шубін та B.Þ.Óâàров (53) 612,015 (088.8) (56) Імунологічні методи дослідження. М.: Мир, 1988, з, 125, (54) СПОСІБ ВИЗНАЧЕННЯ БІЛКУ В

РОЗЧИНІ (57) Винахід відноситься до біології, біотехнології та медицини, може бути використане в клініках і застосовуватися для визначення концентрації білка в автоматизованому режимі при біотехнологічних процесах, конкретно для

Винахід відноситься до біології, біотехнології та медицини і може бути використане при кількісному визначенні білка в біологічних рідинах та на етапах технологічних процесів, а саме для солюбілізованих детергентами розчинів мембранних білків.

Мета винаходу вЂ" визначення блоку в присутності поверхнево-активних речовин при одночасному підвищенні точності способу.

Спосіб здійснюють наступним чином.

Знімають спектр розчину поверхнево-активної речовини (ПАР) та досліджуваного розчину білка в ПАР в ультрафіолетовому діапазоні довжин хвиль

200 вЂ" 260 нм, знаходять дві довжини хвилі, при якому поглинання розчинів однаково

). Ы 1656458 А1 сол юбілізованих детергентами розчинів мембранних білків. Мета винаходуявЂ” визначення білка в присутності ПАР при одночасному підвищенні точності способу. Сутність способу полягає в тому, що попередньо знімають спектри поглинання розчинів білка з поверхнево-активною речовиною і поверхнево-активної речовини при тій же концентрації в УФ-діапазоні довжин хвиль 200 вЂ" 260 нм, визначають дві довжини хвилі, при яких помилка визначення концентрації білка мінімальна , а потім розраховують концентрацію досліджуваного білка. Пропонований спосіб дозволяє проводити визначення білка в присутності

ПАР та підвищити точність визначення у 6,4 рази. 1 табл. розраховують концентрацію білка С за формулою

З =(1/! х Е) 2 х А1, )> де вЂ" довжина оптичного шляху;

E>,г вЂ" різницю коефіцієнтів молярної екстинкції при двох знайдених довжинах

А1,г вЂ" різницю величин поглинання розчину досліджуваного білка при довжинах хвиль А1 іА2.

приклад. Визначалися концентрації чотирьох білків; бичачого сироваткового альбуміну (БСА). людського сироваткового альбуміну (ЧСА), цитохрому С коня та міоглобіну кашалоту в розчинах, що містять різну кількість Емульгену 913 (до

0,01 7 j, неіонного детергенту, що широко використовується для виділення мембранних білків.

Помилки п і on діленні кон ентуії,**

Середнє по, БСА та ЧСА

Середнє за гемопротеїнами

Спектри поглинання розчинів укаеанних білків, білків з Емульгенам 913 у різних концентраціях та Емульгену 913 при тих же концентраціях реєструвалися за допомогою спектрофотометра "Gewlett 5

Packard HP-85" (США) у кюветі з довжиною оптичного шляху 1 мм в області довжин хвиль від 200 до 260 нм.

Пошук довжин хвиль проводився за допомогою мінімізації відносної випад- 10 ної помилки визначення концентрації білка по всіх парах довжин хвиль в інтервалі, від 205 до 225 нм і з використанням ЕОМ.

Одночасно розраховувалася концентрація білка за формулою 15

З = К1л ЛА a де K1,2 = 1/! х Е1,2, в якій величина К1,z була усереднена по 11 білках, фосфоглюкозоізомеразі, гліцерофосфатдегідрогеназі, альдолаеї, тріозо-20 фосфатизомераеї, фосфогліцераткіназе, лактатдеогенезе, , БСА (всі білки фірми " Serva", США), НСА (Fiuca, ФРН).

Розраховані концентрації білків 25 порівнювали з контрольними концентраціями, визначеними гравіметрично. Дані таблиці формули розрахунку концентрації білка можна використовувати з урахуванням похибки для будь-якого досліджуваного білка в розчинах, що містять до 0,01% Емульгена 913 .

Використання пропонованого способу визначення концентрації білка в розчинах, що містять невідому кількість поверхнево-активної речовини, забезпечує в порівнянні з існуючими 40 способами наступні переваги: можливість визначати білок в розчинах, що містять ПАР: можливість більш точної кількісної оцінки концентрації білка (як видно, іе таблиці, приусередненні розрахунком концентрації за трьома формулами, запропонований спосіб дозволяє зменшити похибку оцінки до 7%, по прототипу вЂ" 32%).

У таблиці наведено дані, що характеризують визначення концентрації білка у присутності Емульгена 913.

Крім того, пропонований спосіб зберігає активні властивості білка, що досліджується, і не вимагає використання дорогих реактивів, що зменшує матеріальні витрати і збільшує ефективність використання методу, Формула винаходу

Спосіб визначення білка в розчині, що включає вимірювання поглинання розчину білка в ультрафіолетовій області та розрахунок концентрації білка з урахуванням значення коефіцієнта малярної екстинкції, який відрізняється тим, що з метою визначення білка в присутності поверхнево-активних речовин при одночасному підвищенні точності способу знімають спектр розчину поверхнево -активної речовини в ультрафіолетовій ділянці, знаходять два значення і4 довжини хвилі, при яких поглинання однаково, і розраховують концентрацію білка за формулою

З = (1/! х E ),2) х A1 z, де вЂ" довжина оптичного шляху;

Е1,2 вЂ" різниця коефіцієнтів малярної екстинкції при двох знайдених довжинах хвиль l1 і )2 А1д вЂ" різниця величин поглинання розчину досліджуваного білка при довжинах хвиль А1 і k2 .

* вЂ" відношення вмісту Емульгена 913 до вмісту білка:

** вЂ" . 1 вЂ" розрахунок запропонованим сйособом за формулою С - 0,639 (А2ов вЂ" А224)

2 вЂ" розрахунок за формулою С - 0,846 (A210 вЂ" A224)

3 вЂ" розрахунок за формулою С = 1,113х(А212 вЂ" А224)

4 вЂ" біуретовим методом (2); 5 вЂ" методом Моурі (3).

Техред М.Моргентал Корре ор М,Пожо

Замовлення 2050 Тираж 417 Передплатне

ВНДІПД Державного комітету з винаходів та відкриття при ДКНТСРСР

113035, Москва, Ж-35, Рауська наб., 4/5

Виробничо-видавничий комбінат "Патент", м. Ужгород, вул. Гагаріна, 101