Транскрипція передача інформації про нуклеотидну послідовність ДНК на рівень РНК
е. Регуляція експресії генів на різних етапах утворення РНК та білка
Клітини про- та еукаріотів мають здатність до диференціальної регуляції експресії генів. Так, за певних умов багато генів взагалі не експресуються, а ступінь експресії інших відрізняється на кілька порядків. Зміна умов може призвести до активації генів, що «мовчали» раніше, і репресії активно працювали. Подібна здатність дозволяє клітинам пристосувати свої фенотипи до найрізноманітніших умов навколишнього середовища та фізіологічних впливів. Диференційована експресія одного геному у багатоклітинних організмів зумовлює розвиток величезної кількості типів клітин, що мають специфічні функції, з однієї або кількох зародкових клітин.
Експресія генів, зазвичай, регулюється лише на рівні освіти РНК. Зазвичай регульованим етапом є ініціація транскрипції, при цьому регуляція здійснюється або за допомогою репресорних білків, що запобігають транскрипції, або за допомогою активаторних, необхідних її початку. У першому випадку транскрипція починається тільки після інактивації репресорного білока. У другому ген транскрибується лише тоді, коли білок-активатор перебуває у відповідному функціональному стані. У регуляції транскрипції генів беруть участь як репресорні і активаторні білки. У деяких випадках самі білки – продукти генної експресії – є регуляторами транскрипції власних генів. Ефективність транскрипції також залежить від конформаційного стану ДНК або РНК. Крім того, регуляція синтезу РНК може здійснюватися шляхом контролю швидкості її елонгації або за допомогою «стоп-сигналу» в послідовності, що транскрибується, який може зупинити транскрипцію гена. Модифікація та/або процесинг,які можуть передувати утворенню зрілої функціональної РНК, також регулюються.
Експресія генів може регулюватися і лише на рівні трансляції мРНК з утворенням білків. І в цьому випадку специфічне регулювання, як правило, здійснюється на початковому етапі декодування. Однак контроль може здійснюватися і на різних етапах збирання поліпептидного ланцюга. Більш того, синтез тих білків, які зазнають посттрансляційних модифікацій або транспортуються до місць свого призначення всередині клітини, може регулюватися на кожному з цих етапів.
Пізніше, коли ми проаналізуємо ці докладніше, ми побачимо, що механізми регуляції експресії генів дуже різноманітні, численні і дуже складні. І хоча багатьом із них притаманні загальні риси, тонкі механізми регуляції завжди унікальні для даного гена, певного фізіологічного стану організму та умов довкілля. Аналіз регуляторних механізмів бактеріальних систем дозволив виявити широкий спектр способів регуляції та координації експресії генів. Однак дослідження механізму контролю експресії генів у клітинах еукаріотів тільки починається, а процеси, відповідальні за диференціювання багатоклітинних організмів, поки що залишаються нез'ясованими.
2. Транскрипція: передача інформації про нуклеотидну послідовність ДНК на рівень РНК
У цьому та наступному розділах ми розглянемо деякі аспекти перенесення інформації про нуклеотидну послідовність ДНК на рівень РНК – процесу, відповідального за синтез усіх типів клітинних РНК як у про-, так і у еукаріотів. Переважна кількість піонерських робіт, в яких вивчалася транскрипція, – природа відповідних реакцій та їх субстрати, ферментативний апарат, сигнальні нуклеотидні послідовності, що визначають, які галузіДНК повинні транскрибуватися, деякі способи процесингу, що перетворює первинні транскрипти на зрілі молекули РНК, було виконано на прокаріотів. Паралельне проведення генетичних та біохімічних експериментів дозволило дослідити ферменти, що беруть участь у транскрипції, та механізм самого цього процесу. Зусилля з вивчення транскрипційного і регуляторного апаратів у еукаріотів, що вживаються в той же час, були дуже утруднені і набагато менш успішні головним чином через те, що компоненти їх транскрипційного апарату – ДНК у формі хроматину та РНК-полімерази – були слабо охарактеризовані. Крім того, була невідома природа транскрипційних одиниць, а застосування генетичних підходів для їх визначення було неможливим.
Ситуація різко змінилася з появою методів молекулярного клонування. Зараз багато генів, що становлять різні типи транскрипційних одиниць, виділені, секвеновані і навіть відповідним чином модифіковані з метою дослідження їх функцій. Більше того, використання деяких сучасних підходів дозволило по-новому подивитися на транскрипційний апарат різних організмів – від дріжджів до людини. Маються на увазі методи введення ДНК у культури клітин ссавців і навіть у клітини цілого організму тварин, що застосовуються поряд із традиційними методами дослідження очищених транскрипційних систем in vitro. Одночасно було досягнуто прогресу у встановленні структури хроматину та властивостей еукаріотичних РНК-полімераз. Детальні дані про структуру генів, механізм транскрипції та безпосередньо пов'язаних з нею посттранскрипційні події, що відбуваються при синтезі РНК у еукаріотів.
а. Синтез РНК на ДНК-матриці
Дволанцюжкова молекула ДНК – це фізіологічна матриця для синтезу всіх клітиннихРНК. Навіть якщо геном, як у деяких вірусів, представлений одноланцюгової ДНК, остання перед транскрипцією обов'язково переходить у дволанцюжкову реплікативну форму. Транскрибована може бути будь-яка з двох ланцюгів геномної ДНК, проте матрицею при транскрипції окремого гена зазвичай служить лише одна з них. Втім, у деяких випадках всі мРНК транскрибуються з одного й того ж ланцюга. Дуже рідко транскрипція йде на обох ланцюгах в одному і тому ж місці, так що ланцюги РНК, що утворюються, виявляються комплементарні один одному; можливо, такий спосіб транскрипції має особливе регуляторне значення.
Нуклеотидними попередниками для синтезу РНК є чотири рибонуклеозид-5'-трифосфату: ATP, GTP, UTP та СТР. Багато РНК містять модифіковані нуклеотиди, але зміни у основах і рибозних залишках відбуваються після полімеризації, тобто. посттранскрипційно. Тим не менш, РНК-полімерази можуть використовувати рибонуклеозид-5'-трифосфати, відмінні від зазначених чотирьох, за умови, що модифіковані підстави мають здатність до спаровування, порівнянної з такою для аденіну, гуаніну, цитозину та урацилу.
РНК-полімерази каталізують реакцію приєднання 3'-ОН-групи нуклеотиду, що знаходиться на кінці ланцюга, до а-фосфату наступного рибонуклеозид-5'-трифосфату. Багаторазове повторення цієї реакції призводить до поступового подовження ланцюга РНК. Утворення кожного нового фосфодіефірного зв'язку супроводжується вивільненням неорганічного пірофосфату; швидкий гідроліз пірофосфату до неорганічного фосфату in vivo робить реакцію утворення фосфодіефірного зв'язку енергетично вигідним.
Транскрипція аналогічна реплікації тому, що її здійснення також потрібна ДНК-матриця. Порядок приєднання нуклеотидів визначаєтьсякомплементарним спарюванням підстав. Щоб могло відбуватися комплементарне спарювання кожного наступного нуклеозидтрифосфату з матричною основою, що транскрибується, спіраль ДНК під час транскрипції повинна розкручуватися за допомогою ДНК-полімерази. Ланцюг РНК, що росте, залишається пов'язаним з ферментом і спареним своїм зростаючим кінцем з ділянкою матричного ланцюга довжиною 20–30 нуклеотидів; решта ланцюга, що утворився, не пов'язана ні з ферментом, ні з ДНК. У міру продовження транскрипції ланцюги ДНК, що тимчасово розійшлися, возз'єднуються і відновлюється вихідна дуплексна структура. Таким чином, транскрипція – процес консервативний, у якому зберігається подвійна спіраль ДНК, а синтезований ланцюг РНК відокремлюється. На противагу цьому реплікація ДНК напівконсервативна, оскільки обидва ланцюги вихідного дуплексу розподіляються за двома дочірніми спіралями. Інша істотна відмінність між реплікацією та транскрипцією ДНК полягає в тому, що реплікація не може початися без затравки – праймера, а ініціація синтезу РНК за допомогою РНК-полімерази відбувається de novo, починаючи з рибонуклеозидтрифосфату, що відповідає першому нуклеотиду в ланцюзі РНК.