Трансплантація кісткового мозку мишам із експериментальною моделлю туберкульозу

Ісаєв А.А., Поспєлов Л.Є., Бочарова І.В., Гегерт В.Я., Станков Д.С., Приходько О.В., Авдієнко В.Г., Поспєлов А.Л.

ДЛЯ ТОГО ЩОБ СКАЧАТИ СТАТТЮ У ФОРМАТІ PDF ВАМ НЕОБХІДНО АВТОРИЗУВАТИСЯ, АБО ЗАРЕЄСТРУВАТИСЯ

Досліджували ефективність застосування клітин кісткового мозку (ККМ) у лікуванні експериментального туберкульозу. Було показано, що трансплантація алогенних клітин кісткового мозку від мишей лінії AKR, резистентних до туберкульозу, мишам лінії C57BL/6, чутливим до туберкульозу і зараженим мікобактеріями штаму H37Rv, дозволила значно продовжити життя зараженим експериментальним тваринам, зменшити число порівняно з нелікованими тваринами. Вивчення гуморального імунітету показало, що введення алогенних клітин кісткового мозку призводить до неспецифічної поліізотипічної стимуляції протитуберкульозних антитіл, що є важливим у створенні протективного гуморального фону. Також було виявлено виражену вироблення IgG2a антитіл порівняно з рівнем IgG1 антитіл при терапії клітинами кісткового мозку, яка вказує на наявність Thl-відповіді, що носить при туберкульозі явний протективний характер. Високий рівень IgG2a антитіл корелював з високим рівнем специфічної імунної клітинної імунної відповіді, що оцінюється за реакції гіперчутливості уповільненого типу (ГЗТ).

Вступ

Метою роботи було вивчення впливу клітин кісткового мозку при лікуванні експериментального туберкульозу, викликаного мікобактеріями штаму H37Rv, миші лінії C57BL/6. Для цього визначали показники виживання тварин після зараження, висівання мікобактерій з органів заражених тварин, реакцію гіперчутливості уповільненого типу [ГЗТ] на туберкулін та специфічну античну відповідь притрансплантації клітин кісткового мозку [ККМ] Матеріал та методи. Експериментальні тварини та трансплантація ККМ

Для експериментальних досліджень використовували мишей інбредних ліній C57BL/6, AKR, що містяться в розпліднику ГУ ЦНДІТ РАМН. Клітини кісткового мозку отримували з стегнових кісток мишей лінії AKR і C57BL/6 на холоду, ресуспендували в середовищі 199, одноразово відмивали в середовищі 199 і доводили до концентрації 6 млн клітин 0,3 мл суспензії на 1 ін'єкцію на мишу. Миші лінії AKR вважаються резистентними до мікобактерій туберкульозу (МБТ), а миші лінії C57BL/6 - чутливими. Цей висновок було зроблено на підставі висівання життєздатних мікобактерій з органів мишей різних ліній, а також на підставі виживання тварин після зараження M.tuberculosis H37Rv [3, 4].

При виборі дози трансплантації ККМ виходили з факту, що хвороба рант у мишей розвивається при введенні більше 10 млн клітин селезінки дорослих донорів.

Мишей лінії C57BL/6 заражали смертельною дозою (1х107 КУО) мікобактерій туберкульозу H37Rv.

Усі експериментальні тварини були поділені на такі групи:

1 група – інфіковані тварини, які не отримують лікування – 10 шт;

2 група – інфіковані тварини, які отримують протитуберкульозний препарат ізоніазид у дозі 38,5 мг/кг -10 шт;

3 група - інфіковані тварини, які отримують протитуберкульозний препарат ізоніазид у дозі 38,5 мг/кг та ККМ лінії AKR [алогенная трансплантація] - 10 шт;

4 група - інфіковані тварини, які одержують тільки ККМ лінії AKR [алогенная трансплантація] - 10 шт;

5 група - інфіковані тварини, які отримують тільки ККМ лінії C57BL/6 [сингеннатрансплантація] – 10 шт.

Ізоніазид вводили внутрішньошлунково через 3 дні після зараження щодня протягом 2 місяців, ККМ вводили внутрішньовенно у хвостову вену мишей також через три дні після зараження щотижня протягом 2 місяців.

Також для вивчення впливу ККМ на реактивацію туберкульозного процесу мишам C57BL/6, зараженим 1 х107 ДЕЯ МБТ, протягом 2 місяців щодня, через 2 тижні після зараження, вводили перорально протитуберкульозні препарати ізоніазид і рифампіцин. Потім частину експериментальних тварин залишали для реактивації туберкульозного процесу [група 6], а іншій групі мишей вводили щотижня протягом двох місяців ККМ лінії AKR (група 7). Після цього у частини тварин із двох порівнюваних груп висівали МБТ із органів (легких).

Імуноферментний аналіз

Імуноферментний аналіз проводили у 96 лункових планшетах з високою зв'язувальною здатністю (Costar, США), які сенсибілізували комплексним антигенним препаратом культурального фільтрату Mycobacterium tuberculosis H37Rv у концентрації 10 мкг/мл протягом 18 годин при 4оС. Після відмивання PBS, що містить 0,1% Tween 20, планшети вносили сироватки досліджуваних тварин у розведеннях 1:400, 1:1600, 1:6400. Після годинної інкубації та відмивання PBS-Tween до планшетів додавали розведення других антитіл, мічених пероксидазою хрону, імунопероксидазні кон'югати, спрямовані проти полівалентних IgG (Sigma, США), підкласів IgG1, IgG2a (ICN, США), IgM . Після інкубації протягом години планшети відмивали PBS-Tween і лунки вносили субстрат кольорової реакції, що містить цитратний буфер, перекис водню і тетраметилбензидин. Після інкубації у темряві протягом 15 хвилин реакцію зупиняли 1M сірчаною кислотою. Оптичну густину зчитували при 450нм.

Реакція гіперчутливості уповільненого типу

Для вивчення рівня специфічного протитуберкульозного клітинного імунітету ставили реакцію ГЗТ. Для цього в подушку однієї з рук досвідчених тварин вводили туберкулін, а в іншу (контроль) - фізіологічний розчин і порівнювали рівень місцевої реакції шкіри кожної з лап.

Статистика

Для порівняння тварин за виживання розраховували середню тривалість життя тварин у групі і порівнювали за стандартним критерієм Стьюдента.

При розрахунку рівня антитіл кожне розведення сироватки розраховували як середнє групи з 4-5 тварин з урахуванням помилки середнього.

Для порівняння кількості мікобактерій з органів заражених тварин і порівняння показників ГЗТ також використовували стандартний критерій Стьюдента.

Результати та обговорення

Основними показниками резистентності тварини до туберкульозу є термін виживання після інфікування та кількість мікобактерій, що висіваються з тропних до туберкульозу органів експериментальних тварин.

Як показали дослідження, у заражених мишей лінії C57BL/6 контрольної групи, які не отримували жодних препаратів, виживання після смертельної дози зараження становило 24,8±1,42 дні. Виживання мишей, яким вводили сингенні клітини (5-я група), була практично порівнянна з контролем. Миші, які отримували щодня ізоніазид протягом 2 місяців (2-я група), ізоніа-зид і клітини кісткового мозку одночасно (3-я група) і тільки клітини кісткового мозку (4-я група) залишалися живими протягом всього терміну спостереження - 6 місяців. Результат виживання мишей представлений у табл. 1.

Після закінчення лікування, через 2 місяці та через 4 місяці частина тварин (по 3 миші з кожної групи) була умертвленадля оцінки висівання мікобактерій туберкульозу з органів мишей (решта тварин залишили для подальшого спостереження). Результати висівання мікобактерій туберкульозу представлені в табл. 2.

Як очевидно з табл. 2, навіть після 2 місяців після закінчення трансплантації ККМ (група 4) кількість мікобактерій в органах була значно знижена порівняно з тваринами без лікування, які загинули через 24,8 дні. У першому розведенні клітинної суспензії легких мишей з груп 3 і 4 не вдалося виявити колонії мікобактерій, що виросли.

МБТ висівалися з легких мишей, які отримували лише ККМ. Через 4 місяці після закінчення лікування з легких заражених мишей усіх груп висівали МБТ, хоча в групах із застосуванням хіміотерапії число колоній було значно менше порівняно з групою мишей, яким вводили тільки ККМ. Різниця була статистично достовірною.

Рівень процесу реактивації оцінювали за висіванням МБТ з легких мишей груп 6 і ​​7. У мишей, які отримували тільки хіміотерапію [група 6) рівень висіваних МБТ дорівнював [2,93±1,54) х 102, а у мишей, яким вводили додатково алогенні ККМ лінії AKR [група 7), рівень висівання МБТ дорівнював (1,60±0,46) х 102. Однак різниця не була статистично достовірна.

У табл. 3 наведено результати дослідження рівня специфічних антитіл [оптична щільність при 450 нм] у порівнюваних групах заражених тварин залежно від розведення та досліджуваного класу або підкласу. Як видно з наведених даних, група тварин, які отримували терапію алогенним трансплантатом клітин кісткового мозку, має значно вищі значення рівня антимікобактеріальних антитіл у всіх досліджуваних класах. Також високі рівні антитіл спостерігаються і при дослідженні антитільної відповідіпідкласів IgG, IgG1, IgG2a. Аналогічна картина спостерігається щодо IgA антитіл. Відповідь IgG2a антитіл має більш виражений характер порівняно з відповіддю IgG1 антитіл.

Найбільш помітний факт при дослідженні антимікобактеріальних антитіл виявляється в групі мишей, які отримували алогенний трансплантат клітин кісткового мозку. Він проявляється в поліізотиповій стимуляції імуноглобулінів усіх класів, що призводить до високої авидності [рівня) серед усіх класів. При тривалій хіміотерапії також зберігається підвищений рівень антитіл IgG та IgM класів. Аналогічна відповідь спостерігається при протективній відповіді на L-арабіноманнан, що відображає рівень його експресії мікобактерією, і безпосередньо залежить від кількості збудників в органах господаря [5].

При вивченні рівня специфічного клітинного імунітету показано, що він був найнижчим при застосуванні хіміотерапії [табл. 4). Найбільш високу специфічну клітинну імунну відповідь, що оцінюється по реакції ГЗТ, виявлено в групі мишей, яким вводили клітини кісткового мозку.

При вивченні рівня реактивації туберкульозного процесу по висоті специфічної антитільної відповіді у мишей у групах 6 і 7 виявлено значне нівелювання рівнів відповіді, хоча вищі показники спостерігаються у групі, яка отримувала тільки хіміотерапію для антимікобактеріальних полівалентних IgG, IgG2a та IgM антитіл [табл. 5).

Список захворювань, в терапії яких дослідники та клініцисти намагаються використовувати стовбурові клітини, постійно розширюється. Однак при лікуванні інфекцій цей список поки не такий великий, до нього відноситься, наприклад, ВІЛ-інфекція, в терапії якої досягнуто певних позитивних результатів [1, 2]. При використанні клітин кісткового мозку в терапії експериментального туберкульозу умишей нами показаний протективний ефект щодо туберкульозної інфекції, що виражається у значному збільшенні життя мишей та стримуванні зростання мікобактерій у досліджуваних органах заражених тварин.

Наявність протитуберкульозних IgA не настільки виражена у всіх групах, за винятком групи, яка одержувала клітини кісткового мозку, що, як і у випадку з IgG та IgM класами, має неспецифічний характер поліізотипічної стимуляції. Поява протитуберкульозних антитіл класу IgA проти мікобактеріального антигену альфа-кристал-ліну на ранніх стадіях інфекції дуже важлива для успішної протекції, особливо у разі їх виділення у вигляді секреторних IgA [8].

З високим рівнем специфічних IgG2a антитіл корелює і високий рівень реакції ГЗТ у групах досвідчених тварин, які отримували як лікування трансплантацію ККМ, незважаючи на хіміотерапію, що застосовується.

Висновок

Підсумовуючи вищесказане, можна зробити деякі попередні висновки:

- трансплантація алогенних клітин кісткового мозку зараженим мікобактеріями мишам дозволила значно продовжити життя зараженим експериментальним тваринам, а також знизити рівень висівання МБТ з органів заражених мишей;

- введення алогенних клітин кісткового мозку призводить до неспецифічної поліізотипічної стимуляції вироблення протитуберкульозних антитіл, що є важливим у створенні протективного гуморального фону;

- Виражена вироблення IgG2a антитіл у порівнянні з рівнем IgG1 антитіл при терапії клітинами кісткового мозку, вказує на наявність Th1-відповіді, який носить при туберкульозі явний протективний характер.

Подальша робота буде присвячена дослідженню впливу різних фракцій клітин кісткового мозку під час лікування експериментального туберкульозу.

---