Виготовлено бактерію з синтетичним мінімальним геномом • Олександр Марков • Новини науки на
Мал. 1.Група бактерій JCVI-syn3.0 з синтетичним мінімальним геномом, що містить всього лише 473 гени - менше, ніж у будь-якого іншого організму, що самостійно розмножується. Мінливий розмір клітин - одна з відмінних рис нового мікроба.Довжина масштабного відрізка- 200 нм. Фото з обговорюваної статті уScience
Співробітники інституту Крейга Вентера повідомили про новий успіх на шляху створення штучних мікроорганізмів із заданими властивостями. Використовуючи розроблені раніше методи виготовлення синтетичних геномів та впровадження їх у бактеріальні клітини, дослідники створили життєздатну бактерію, геном якої містить лише 531 тисячу пар основ і 473 гени — менше, ніж у будь-яких існуючих у природі мікробів, здатних до самостійного розмноження. У ході роботи стало ясно, що сучасні знання про влаштування клітини та функції генів все ще недостатні для проектування геномів з чистого листа, тому без методу проб та помилок обійтися поки не вдається. Функції 149 з 473 генів «мінімального геному» невідомі: експерименти показали, що ці гени необхідні для сталого зростання бактерій, але що саме вони роблять, ще потрібно з'ясувати.
Крейг Вентер (John Craig Venter) та співробітники створеного ним інституту (J. Craig Venter Institute) зробили черговий важливий крок на шляху до своєї головної мети створення штучних мікробів з бажаними властивостями.
До цієї мети Крейг Вентер і його колеги методично рухаються вже більше 20 років, починаючи з прочитання в 1995 геному бактеріїMycoplasma genitalium- організму, що володіє найменшим геномом з усіх живих істот, здатних до автономного розмноження (внутрішньоклітинні парази)облігатні симбіонти на кшталтNanoarchaeumне беруться до уваги, оскільки вони користуються для свого розмноження послугами чужої клітини, що потенційно дозволяє їм зменшувати свій геном хоч до нуля).
УM. genitaliumв геномі всього 583 тисячі пар основ (п. о.) та 525 генів. Однак ця бактерія розмножується за мікробіологічними мірками дуже повільно (подвоює свою чисельність за 16 годин) і експериментувати з нею незручно. Тому дослідники використовують як основний об'єкт іншу мікоплазму,Mycolasma mycoides. Її геном вдвічі більший, зате і розмножується вона у 16 разів швидше.
На перший погляд завдання здається не таким складним, але це оманливе враження. Очевидний підхід до її вирішення - порівняти геноми безлічі різних мікробів і знайти гени, які є у всіх без винятку. На жаль, цей спосіб не працює: мінімальний набір, який вдається виявити з його допомогою, складається приблизно з 250 генів і явно недостатній для життя клітини. Справа в тому, що багато важливих функцій можуть з успіхом виконуватися різними, несхожими одна на одну генами. Тому в геном кожного мікроба є гени, які не є надконсервативними (тобто відсутні у багатьох інших мікробів), але при цьому абсолютно необхідні. Як наслідок, щоб спроектувати мінімальний геном, потрібно або точно знати функцію кожного гена і повний набір необхідних для життя функцій, або провести величезну експериментальну роботу з визначення мінімального набору генів методом проб і помилок.
Дослідники видалили з геномного тексту синтетичної бактерії syn1.0 все те, що здалося їм зайвим на основі знань, накопичених молекулярною біологією. Залишено були тільки гени з встановленими (і при цьому життєво важливими) функціями, а також ті,яким були експериментальні дані, що свідчать про їх незамінність.
Вісім вісімок геному, спроектовані заново з урахуванням цієї обставини, виявилися сумісними з життям кожна окремо (тобто в комбінації з рештою сімох восьмих вихідного геному syn1.0), але всі разом вони знову виявилися нежиттєздатними. Цього разу причина була в тому, що деякі необхідні функції виконуються двома взаємозамінними генами, розташованими в різних вісімках. У ході індивідуальної перевірки кожен із цих генів був класифікований як «надлишковий», оскільки з його функцією успішно справлявся другий ген. Однак одночасне видалення обох генів виявилося фатальним. Щоб вичистити ці помилки, вченим довелося довго вивчати методом транспозонного мутагенезу проміжні штами, у яких кілька фрагментів геному було відредаговано, інші збережені у вихідному вигляді. Виловлювалися гени невідредагованих елементів, які в таких штамів стали незамінними, хоча були такими у syn1.0. У результаті вдалося скласти список пар генів, у тому числі можна видалити один, але з обидва.
Коли ця та багато інших труднощів були нарешті подолані, світ з'явився синтетичний мікроб syn3.0 (назва syn2.0 дісталося одному з проміжних результатів роботи) — володар найменшого геному з усіх клітинних форм життя, здатних до автономного розмноження. Його геном — найкраще нині наближення до ідеалу «мінімального геному» (рис. 2).
Мал. 2.Зліва- технологія виготовлення мінімального геному: цикл "Дизайн - Складання - Тестування" (Design - Build - Test). Геномні тексти проектуються на комп'ютері (Design), потім виготовляються синтетичні короткі фрагменти - олігонуклеотиди (Synthesis),яких за допомогою складного багатоступеневого процесу збирається цілий геном (Construction). Цей геном розмножується в дріжджових клітинах (Cloning), виділяється в чистому вигляді (Isolation) і додається в культуру клітин Mycoplasma capricolum, деякі з яких заковтують ці геноми (Transplantation), а потім діляться, передаючи частини своїх нащадків тільки синтетичний геном. Залишається перевірити, чи такі нащадки будуть життєздатними і оцінити швидкість їх розмноження (Outgrowth).Дело- вихідний геном syn1.0 (зовнішнє кільце) і виготовлений на його основі мінімальний геном syn3.0 (внутрішнє кільце). Зображення з обговорюваної статті уScience
Геном syn3.0 значно менше, ніж в колишнього рекордсменаM. genitalium: він містить 531490 п. о., 438 білок-кодуючих генів і 35 генів функціональних РНК. При цьому syn3.0 розмножується вп'ятеро швидше, ніж M. genitalium (але все ж таки втричі повільніше, ніж syn1.0), подвоюючи свою чисельність за три години. Автори могли б прибрати ще кілька «квазі-необхідних» генів, пожертвувавши швидкістю зростання, але вирішили цього не робити, щоб не ускладнювати собі подальшу роботу.
Що ж є отриманий «мінімальний геном»? З 901 гена syn1.0 було видалено майже половину (428). Серед віддалених переважають гени білків з невідомими функціями, гени ліпопротеїнів, мобільні елементи, а також гени, пов'язані з тими аспектами метаболізму, які не потрібні для життя в лабораторному поживному середовищі, що містить усі необхідні бактеріям малі молекули. Наприклад, оскільки в цьому середовищі багато глюкози, більшість генів, пов'язаних з транспортом та метаболізмом інших цукрів, вдалося безболісно прибрати, залишивши тільки гени, необхідні для поглинання та засвоєння глюкози.
Середгенів, що залишилися у syn3.0, переважають гени, пов'язані зі збереженням, розмноженням та зчитуванням генетичної інформації (репарація, реплікація, транскрипція, трансляція), з клітинним поділом, а також гени мембранних білків. Оскільки syn3.0 не здатна синтезувати амінокислоти, нуклеотиди, вітаміни та інші малі молекули, вона повинна отримувати все це із середовища, а для цього потрібні транспортні білки, які локалізовані в клітинній мембрані.
Найцікавіше, що про функцію значної частини генів syn3.0 мало що відомо. Для 65 генів з 473 функція невідома зовсім, а 84 про неї можна лише невиразно здогадуватися за подібністю амінокислотних послідовностей з вивченими білками інших організмів. У багатьох із цих загадкових генів є родичі (теж з невідомою функцією) в геномах інших організмів - від архей до Homo sapiens. Очевидно, вони справді виконують у клітині якісь дуже важливі, але поки що не розшифровані функції. Це показує, наскільки неповними є наші знання про влаштування живої клітини.
Зовнішній вигляд нових мікробів теж зробив сюрпризи (рис. 3). У рідкому середовищі бактерії syn3.0, на відміну syn1.0, не плавають поодинці, а осідають на дно, де утворюють біоплівки з різноманітними структурами, то шикуючись акуратними рядами, то роздуваючись або зливаючись у великі бульбашки. Крім того, в скупченнях syn3.0 крім клітин звичайного розміру (0,5-1,0 мкм) є багато дрібниць, причому, мабуть, життєздатної (живі клітини, здатні утворювати нові колонії, проходять через фільтр з діаметром пор 0, 2 мкм). Ймовірно, в процесі редагування геному дослідники видалили якісь гени, що забезпечують стійкість розвитку, стабілізують процес клітинного поділу або структуру мембран, що призвело до зростання випадкової.мінливості клітин. Автори повідомляють, що схожі фенотипи спостерігалися раніше у деяких мікоплазм при вирощуванні в нестандартних умовах, у яких могли змінитися процеси синтезу ліпідів та властивості мембран.
Мал. 3.Зовнішній вигляд колоній syn1.0 та syn3.0. У рідкому середовищі клітини syn1.0 плавають окремо (вгорі зліва), тоді як syn3.0 осідають на дно (вгорі справа), де утворюють біоплівки з нитчастими багатоклітинними структурами (>білі стрілки) і незрозумілими великими бульбашками (чорні стрілки). Для клітин syn3.0 також характерний великий діапазон мінливості за розміром (внизу).Довжини масштабних відрізків: 10 мкм (верхні фотографії) та 1 мкм (нижні фотографії). Зображення з обговорюваної статті уScience
Крейг Вентер і його колеги наостанок ще поекспериментували з геномом syn3.0, переставляючи гени з місця на місце (багато генів вдалося згрупувати за функціями, що повинно полегшити роботу майбутнім дизайнерам), замінюючи в генах кодони на синонімічні і вносячи однонуклеотидні рибосомних РНК. Все це не вплинуло на життєздатність штучного мікроба, який, отже, зберіг якийсь рівень генетичної пластичності і може бути підданий додаткової оптимізації.