Визначення мутації в гені кальретикуліну у пацієнтів із підозрою на хронічні
Проведено аналіз результатів молекулярно-генетичного дослідження периферичної крові 363 пацієнтів із підозрою на хронічне мієлопроліферативне захворювання. Наявність мутацій у гені кальретикуліну (CALR) визначали оригінальним методом полімеразної ланцюгової реакції з електрофоретичною детекцією. Мутації в гені CALR виявлено у 30 з 58 пацієнтів з есенціальною тромбоцитемією (ЕТ) та мієлофіброзом (МФ) та відсутністю мутацій у генах JAK2 (V617F) та MPL. Тільки у 1 пацієнта з ЕТ було одночасне поєднання двох різних мутацій у генах JAK2 (V617F) та CALR (del). Не виявлено мутацій у гені CALR серед пацієнтів з верифікованою істинною поліцитемією, іншими онкогематологічними захворюваннями та при вторинних тромбоеритроцитозах. Мутації CALR були приблизно однаково представлені як у чоловіків, так і у жінок з тенденцією до переважання відносно молодих пацієнтів. Вулиць з мутаціями в гені CALR при ЕТ реєструвалася менша кількість еритроцитів та тенденція до більш вираженого тромбоцитозу. Використання в діагностичному алгоритмі додаткового молекулярно-генетичного тестування на наявність мутацій у гені CALR у 2 рази збільшує післятестову ймовірність виявлення клонального характеру захворювання, дозволяє досягти 80% чутливості тестування при діагностиці ЕТ та МФ та виключити наявність істинної поліцитемії. Тест виявлення мутацій CALR може бути рекомендований для включення до стандартного протоколу диференціальної діагностики хронічних мієлопроліферативних неоплазій.
Identification of mutation in calreticulin gene in patientsз підозрою на хронічні мієлопроліферативні захворювання
У 363 пацієнтів з підозрою на хронічне мієлопроліферативне захворювання проведено молекулярно-генетичний аналіз периферичної крові. Мутації в гені кальретикуліну (CALR) виявлені оригінальним методом ПЛР з електрофоретичною детекцією. У 30 з 58 пацієнтів з есенціальною тромбоцитемією (ЕТ) і мієлофіброзом (МФ) і без мутацій в генах JAK2 (V617F) і MPL виявлені мутації в гені CALR. Тільки в одного пацієнта з ЕТ була комбінація двох різних мутацій в генах JAK2 (V617F) і CALR (del). У пацієнтів з верифікованою справжньою поліцитемією, іншими онкогематологічними захворюваннями та вторинним тромбоеритроцитозом мутацій гена CALR не виявлено. Мутації CALR виявлялися приблизно однаково у чоловіків і жінок, з тенденцією до переважання у молодших пацієнтів. Пацієнти з мутаціями CALR і ET мали нижчу кількість еритроцитів і демонстрували тенденцію до вираженого тромбоцитозу. Використання додаткового молекулярно-генетичного тестування на CALR-мутації в рамках діагностичного алгоритму підвищило в 2 рази післятестову ймовірність виявлення клонального патерну захворювання, допомогло досягти 80% чутливості тестування в діагностиці ЕТ і МФ та щоб виключити справжню поліцитемію. Виявлення мутацій CALR можна рекомендувати для додавання до стандартного протоколу диференціальної діагностики хронічних мієлопроліферативних захворювань.
Текст научной работы на тему «Визначення мутації в гені кальцикуліну у пацієнтів з подозрением на хронічні мієлопроліферативні неоплазії»
О КОЛЕКТИВ АВТОМОБІЛІВ, 2014 >ДК 616.155-006.04:577.21.8
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МУТАЦИИ В ГЕНЕ КАЛЬРЕТИКУЛИНА У ПАЦИЕНТОВ С ПОДОЗРЕНИЕМ НА ХРОНИЧЕСКИЕ МИЕЛОПРОЛИФЕРАТИВНЫЕНЕОПЛАЗІЇ
Ольховський І.А.1'2, Горбенко А.СЛ2, Столяр М.А.1,2,3, Суботіна Т.Н.1'3, Васильєв Є.В.4, Виноградова О.Ю.4, Мартинова Е .В.4, Москов В.І.4, Азаренко Г.М.4, Смілянська М.Г.4, ОльховикТ.І.5, Осадча М.Г.5, Кисличенко О.Р.5, Михалєв М.А .5, Фандо Ж.Г.5, Бахтіна В.ІЛ4'6, Кузнєцова Е.Ю.5(5, Рикун Л.А.7, Шалькова І.В.8
красноярська філія ФДБУ Гематологічний науковий центр МОЗ України, 660036, Красноярськ, Україна; 2ФГБУН Красноярський науковий центр СО РАН, 660036, Красноярськ, Україна; 3ФГАОУ ВПО Сибірський федеральний університет, 660041, Красноярськ, Україна; 4КДБУЗ Крайова клінічна лікарня, 660022, Красноярськ, Україна; 5МБУЗ Міська клінічна лікарня № 7,660003, Красноярськ, Україна; 6ГОУ ВПО Красноярський державний медичний університет ім. проф. В.Ф. Війно-Ясенецького МОЗ України, 660022, Красноярськ, Україна; 7НМУ Дорожня лікарня на ст. КрасноярськОАТ РЖД, 660058, Красноярськ, Україна; 8ФГУЗ Клінічна лікарня №51 ФМБА РФ, 662970, Залізногірськ, Україна
Резюме Проведено аналіз результатів молекулярно-генетичного дослідження периферичної крові 363 пацієнтів із підозрою на хронічне мієлопроліферативне захворювання. Наявність мутацій у гені кальретикуліну (CALR) визначали оригінальним методом полімеразної ланцюгової реакції з електрофоретичною детекцією. Мутації в гені CALR виявлено у 30 з 58 пацієнтів з есенціальною тромбоцитемією (ЕТ) та мієлофіброзом (МФ) та відсутністю мутацій у генах JAK2 (V617F) та MPL. Тільки у 1 пацієнта з ЕТ було одночасне поєднання двох різних мутацій у генах JAK2 (V617F) та CALR (del). Не виявлено мутацій у гені CALR серед пацієнтів з верифікованою істинною поліцитемією, іншими онкогематологічними захворюваннями та при вторинних тромбоеритроцитозах. Мутації CALR булиприблизно однаково представлені як у чоловіків, так і у жінок, з тенденцією до переважання відносно молодих пацієнтів. Вулиць з мутаціями в гені CALR при ЕТ реєструвалася менша кількість еритроцитів та тенденція до більш вираженого тромбоцитозу. Використання в діагностичному алгоритмі додаткового молекулярно-генетичного тестування на наявність мутацій у гені CALR у 2 рази збільшує післятестову ймовірність виявлення клонального характеру захворювання, дозволяє досягти 80% чутливості тестування при діагностиці ЕТіМФ та виключити наявність істинної поліцитемії. Тест виявлення мутацій CALR може бути рекомендований для включення до стандартного протоколу диференціальної діагностики хронічних мієлопроліферативних неоплазій.
Ключові слова: кальретикулін; соматичні мутації; есенціальна тромбоцитемія; міє-лофіброз; справжня поліцитемія.
IDENTIFICATION OF MUTATION IN CALRETICULIN GENE IN PATIENTS WITH SUSPICION ON CHRONIC MYELOPROLIFERATIVE DISEASES
Olkhovskyl.A.12, GorbenkoA.S.12, StolyarM.A.' 23, Subbotina T.N.' 3, ВасільєвЕ.В.4, Віноградова Е.Ю.4, Мартинова Е.В.4, Москов В.І.4, Азаренко Г.Н.4, Смельянська М.Г.4, Ольховик Т.І.5, ОсадчаяМ.Г. .G.5, Bakhtina Vl''46, Kuznetsova E.Yu.5'6, Рикун L.A.7, Шалкова I.V."
'Красноярськ Affiliated Department, Hematological Research Center, 660036, Красноярськ, Росія; Красноярськ Research Center, 660036, Красноярськ, Росія; Siberian Federal University, 660041, Красноярськ, Росія; territorial Clinical Hospital, 660022, Красноярськ, Росія; 6V.F.Voino-Yasenetsky Krasnoyarsk State Medical University, 660022, Krasnoyarsk, Russia;7Railroad Hospital, 660058, Krasnoyarsk,Росія; 8 Клінічна лікарня № 51, 662970, м. Желєзногорськ, Росія
Підсумок. У 363 пацієнтів з підозрою на хронічне мієлопроліферативне захворювання проведено молекулярно-генетичний аналіз периферичної крові. Мутації в гені кальретикуліну (CALR) виявлені оригінальним методом ПЛР з електрофоретичною детекцією. Мутації в гені CALR були виявлені у 30 із 58 пацієнтів з есенціальною тромбоцитемією (FT) і мієлофіброзом (MF) і без мутацій в генах JAK2 (V617F) і MPL. Лише в одного пацієнта з ФТ була комбінація двох різних мутацій в генах JAK2 (V617F) і CALR (del). У пацієнтів з верифікованою справжньою поліцитемією, іншими онкогематологічними захворюваннями та вторинним тромбоеритроцитозом мутацій гена CALR не виявлено. Мутації CALR виявлялися приблизно однаково у чоловіків і жінок, з тенденцією до переважання у молодших пацієнтів. Пацієнти з мутаціями CALR і ET мали нижчу кількість еритроцитів і демонстрували тенденцію до вираженого тромбоцитозу. Використання додаткового молекулярно-генетичного тестування на мутації CALR в рамках діагностичного алгоритму підвищило в 2 рази післятестову ймовірність виявлення клонального патерну захворювання, допомогло досягти 80% чутливості тестування в діагностиці ФТ та МФ та до виключити справжню поліцитемію. Виявлення мутацій CALR можна рекомендувати для додавання до стандартного протоколу диференціальної діагностики хронічних мієлопроліферативних захворювань.
Ключові слова: кальретикулін; соматичні мутації; есенціальна тромбоцитемія; мієлофіброз; справжня поліцитемія.
Кальретикулін (Са1 retici.il ¡п, САЬЯ) є багатофункціональним кальцій-зв'язуючим білком ендоплазматичного ретикулума. Крім регуляції кальцію внутрішньоклітинної концентрації, цей
Білок бере участь у формуванні третинної структури білків, володіючи функціями шаперона. За його участю відбувається утворення повноцінного антигенпрезентуючого макромолекуляру.
ного комплексу МНС1 [1]. Підвищена експресія CALR пов'язана з успішною імунною цитотоксічеською реакцією проти пухлинних клітин і визначає сприятливий результат хіміотерапії [1,2].
Мета роботи – провести оцінку діагностичної значущості молекулярно-генетичного визначення мутацій у гені CALR у пацієнтів із підозрою на хронічні мієлоїдні неоплазії.
матеріали та методи
Olkhovskiy Igor, MD, PhD, Docent ([email protected]).
боцитозу, високі значення гемоглобіну та гематокриту, а також підозра на первинний МФ. Остаточний діагноз встановлювали виходячи з критеріїв ВООЗ [9]. Гістологічне дослідження кісткового мозку проводили спеціалісти лабораторії КДНЗ Красноярське крайове патологоанатомічне бюро. Серед усіх обстежених пацієнтів у 15 осіб було підтверджено онкогематологічне захворювання, відмінне від аналізованих нозологічних одиниць, у тому числі у 5 осіб – хронічний мієлолейкоз, у 2 – мієлодиспластичний синдром, у 3 – хронічний лімфолейкоз, у 1 – неходжкін-ська лім - гострі лейкози. Усі ці хворі, а також 13 осіб, у яких на момент обробки даних залишався діагноз хронічного мієлопроліферативного захворювання неясної етіології, були об'єднані в окрему групу порівняння. Вторинний характер тромбо-цитозу та еритроцитозу був діагностований у 17 та 121 людини відповідно. Групу пацієнтів з МФ через їх невелику чисельність склали хворі як первинним МФ, так і МФ, що розвинулися в результаті прогресії істинної поліцитемії (ІП) та ЕТ.
Проби крові для молекулярно-генетичних досліджень брали з ліктьової вени вранці натще у ваку-тейнер з ЕДТА. Аналіз параметрів гемограми проводили на автоматичному гематологічному аналізаторі XT-2000i (Sysmex Corporation). Виділення ДНК із лейкоцитів цільної крові проводили з використанням реагентів ДНК-сорб-В (ФБУН «Центральний НДІ епідеміології»). Концентрацію ДНК вимірювали з використанням набору dsDNA HS Assay Kit на флюоримі-тре Qubit ("Invitrogen"). Для кількісного виявлення мутації V617F в гені JAK2 (rs77375493) використовували набір реагентів АмпліСенс Піроскрін, Тромбоскрин (ФБУН «Центральний НДІ епідеміології», Москва), піросеквенування проводили на приладі PyroMark Q2. Якісний аналіз на наявність мутацій W515L/K в гені MPZ (rsl21913615 nrsl21913616 відповідно) проводили з використанням набору SNP-скрин (НВО «Синтол») методом полімеразної ланцюгової реакції в режимі реального часу (ПЛР-РВ).
Для статистичної обробки даних використовували пакет прикладних програм Statistica 8.0.
Результати генетичного обстеження пацієнтів із підозрою на хронічні мієлопроліферативні неоплазії
Діагноз ІП ЕТ МФ Інші онкогемато- Вторинний еритро-
логічні захворювання на тромбоцитоз
Кількість пацієнтів, всього
60 104 32 28 138
JAK2 (V617F) 55(91,7%) 58 (55,8%)* 21(67,7%) 0 0
МРІ W515L) 0 5 (4; 8%) 0 0 0
CALR(Ae\) 0 17(16,3%)* 3(9,7%) 0 0
CALR (ins) 0 7 (6,7%) 3 (9,7%) 0 0
Мутації не виявлено:_5(8,3%) 18(17,3%) 5(16,1%)_28(100%)_138(100%)_
Примітка. Подано абсолютні значення та частка (у %) від загального числа пацієнтів у групі. * - в одного з пацієнтів поєднання двох мутацій у генах CALR та JAK2.
Значимість відмінностей варіаційних рад у непов'язанихвибірках оцінювали за допомогою критерію Манна-Уітні, описова статистика представлена у вигляді значень медіани (Ме) та верхнього та нижнього квартилів (С25-С75). Відмінності оцінювали як статистично значущі пріор
Свідоцтво про реєстрацію ЗМІ Ел № ФС77-52970