Визначення сумарної активності
Окремі групи протеолітичних ферментів виявляють максимальну активність за різної кислотності середовища, тому їх активність слід визначати при різних значеннях рН. Нижче наведено один із поширених способів визначення сумарної активності протеолітичних ферментів, в основу якого покладено метод Ансона.
Принцип методу. Ферментним препаратом, виділеним з рослинного матеріалу, діють на розчин стандартного білка (казеїну або гемоглобіну), потім білок, що не розклався, осаджують, а в фільтраті визначають кількість білка, що розклався, за колориметричною реакцією Фоліна або на спектрофотометрі. Приймається, що кількість білка, що розклався, пропорційно вмісту в розчині тирозину. Розраховують протеолітичну активність ферментного препарату на 1 мг білка або 1 г навішування за 1 год.
Хід роботи. Наважку зважують на аналітичних вагах: при аналізі свіжого рослинного матеріалу 5 г, а насіння - 2 г. Свіжий рослинний матеріал розтирають у ступці з рідким азотом, а сухий - з піском і переносять у конічну колбу. Ступку змивають водою. Загальний об'єм води, що додається до навішування, має бути 50 мл. Після цього суспензію наполягають протягом 1 години в холодильнику при періодичному помішуванні. Після настоювання суспензію фільтрують у суху склянку або колбу через складчастий фільтр або осад відокремлюють центрифугуванням протягом 10-15 хв при 5-6 тис. об/хв. Як ферментний препарат використовують фільтрат або надосадову рідину.
При визначенні активності протеолітичних ферментів 2 пробірки доливають по 2 мл ферментного препарату. В одну з пробірок (контрольну) додають 4 мл 14%-ного розчину трихлороцтової кислоти для інактивації ферменту. Потім пробірки додають по 2 мл субстрату(1%-ного розчину казеїну або 1%-ного гемоглобіну) і ретельно перемішують. Пробірки інкубують на водяній бані при 30° точно 30 хв. За цей час під дією протеолітичних ферментів частково гідролізується внесені до дослідної пробірки казеїн або гемоглобін.
Кількість тирозину визначають за реакцією з реактивом Фоліна. Для цього до 0,5 мл фільтрату з кожної пробірки додають 0,5 мл 0,0025 М розчину СуSО4, по 4 мл 0,5 н. розчину NaОН і по 1,5 мл розведеного в 3 рази реактиву Фоліна. Вміст пробірок ретельно перемішують і через 20-30 хв після стабілізації забарвлення визначають оптичну щільність на спектрофотометр при 760 нм або фотоелектроколориметр з червоним світлофільтром.
Приклад розрахунку. Припустимо, що оптична щільність дослідного зразка 0.400, а контрольного 0,240, тобто різниця становить 0,160. Наважка матеріалу 2 г. Розведення 50 мл. Для аналізу взято 2 мл ферментного препарату, що відповідає навішенню 0,08 г. Для перерахунку протеолітичної активності на 1 г необхідно розділити 0,160 на 0,08, що дає 2,00 за 30 хв, а для перекладу на 1 год результат множать на 2 Таким чином, умовна протеолітична активність вихідного матеріалу становить 4,00 одиниці.
Загальна формула для розрахунку:
, (14)
де Ер - протеолітична активність (в умовних одиницях);
D0 - оптична щільність дослідного розчину після фарбування;
Dк - оптична щільність контрольного розчину після фарбування;
2 - коефіцієнт для перерахунку на 1 г;
50 - загальний обсяг витяжки, мл;
m - навішування рослинного матеріалу, г;
V – обсяг витяжки ферментного препарату, взятий для аналізу, мол.
Матеріали та реактиви. 1%-ний розчин казеїну (див. Додаток 1, п.19); 1%-ний розчин гемоглобіну (див. Додаток 1, п. 20); рідкий азот; реактив Фоліна (див. Додаток 1, п. 8); 0,5 та 1 н. NаОН; 1 н. та 0,3 н. НСl; 14%-на трихлороцтова кислота; 0,0025 М розчин СіSO4; 0,5 М розчин Na2CO3; 1/5 М фосфатний буфер рН 8,0 (див. Додаток 1, п.6).
Обладнання. Спектрофотометр; ступка фарфорова; центрифуга; холодильник; водяна баня; колби мірні на 50 та 100 мл; конічні колби на 100мл; воронки; градуйовані піпетки; пробірки.