Визначеннязагальних імуноглобулінів

0,11 130 0,45 500 1,20 1340

а)Метод радіальної імунодифузії

В основу методу покладено метод Манчіні, який заснований на вимірі діаметра кільця преципітації, що утворюється при внесенні молочної сироватки, що досліджується, в лунки, вирізані в шарі агару, в якому попередньо диспергована моноспецифічна антисироватка. Діаметр кільця преципітації прямо пропорційний концентрації імуноглобуліну, що досліджується. Вміст імуноглобулінів визначають щодо стандартної сироватки з відомою концентрацією імуноглобулінів.

Підготовка до аналізу:

Приготування агару з моноспецифічною антисироваткою до імуноглобулінів класів А, G,М.

3% агар «Діфко» або агарозу на 0,1М веронал-мединаловом буфері з рН 8,6 змішують нагрітим до температури 56°С у співвідношенні 1:1з моноспецифічною антисироваткою, в якій концентрація антитіл вдвічі перевищує робочий титр (вказаний на етикет. Розведення антисироватки роблять на 0,1М веронал-мединаловому буфері з рН 8,6. Агар, змішаний з моноспецифічною антисироваткою, розподіляють рівномірним шаром на скляних пластинках розміром 9х12см. Для цього на пластинку поміщають латунну іди пластмасову П-подібну рамку товщиною 1 мм,зверху поміщають другу скляну пластинку, змочену гідрофобною рідиною, і простір між пластинками заливають сумішшю агару і антисироватки в кількості 9мл.

Приготування молочної сироватки:

Пробу молока центрифугують протягом 15хв при 2000об/хв, ставлять у морозильну камеру холодильника на 80-30хв для застигання жиру. Шар жиру видаляють шпателем і нагрівають центрифугат до 37°С. Потім по краплях додають 10% розчин оцтової кислоти, доводячи рН до 4,6 для осадження казеїну. Казеїн беруть в облогу центрифугуванням, асироватку фільтрують через паперовий фільтр.

У шарі агару з моноспецифічною антисироваткою пробійником вирізають поряд дві лунки діаметром 2 мм на відстані 15мм одна від одної. У лунки першого ряду вносять за допомогою мікрошприца по 2мкл стандартної не розведеної та розведеної 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 моноспецифічної сироватки. Лунки наступних рядів заповнюють випробуваною молочною сироваткою обсягом 2 мкл. Пластинки інкубують у вологій камері протягом 24год при температурі 4°С, а пластинки з антисироваткою до імуноглобуліну М-48год.

Після закінчення інкубації вимірюють діаметр кілець преципітації. За даними розведення стандартних сироваток будують калібрувальні криві, що виражають залежність між концентрацією імуноглобулінів та діаметром кілець преципітації. Для цього на напівлогарифмічному папері по осі абсцис відкладають діаметри кілець преципітації стандартної сироватки, а по осі ординат -відома кількість імуноглобулінів (МЕ/мл або мг/мл), що містяться у стандартній сироватці кожного розведення. Точки, що утворюються, з'єднують прямою лінією. Для кожного класу імуноглобулінів будують окремий графік.

Для визначення рівня імуноглобулінів у випробуваній молочній сироватці осі абсцис відкладають діаметр кільця преципітації, потім відновлюють перпендикуляр до перетину з кривою і точку перетину проектують на вісь ординат. Отримане значення відповідає концентрації імуноглобуліну кожного класу, вираженої в МО/мл або мг/мл.

За даними Н.А. Сапожникової (1992), концентрація імуноглобулінів класу G в молоці клінічно здорових корів становить: після пологів - 7,9710,31 мг/мл, у середині лактації - 1,78 +0,09 мг / мл, у період запуску - 8,28 +0, 38мг/мл, у хворих на субклінічний мастит - 15,02+0,87,2,56+0,09і 11,87+0,59мг/мл,імуноглобулінів класу М відповідна 0,3й±0,03, 0,14±0,01, 0,34±0,04 мг/мл та 0,53+0,04, 0,23+0,01 та 0,39± 0,05 мг/мл.

б)Хімічний метод з Бадін і Раусселет.

1) Приготування цинк-саліцилового реактиву.

1,875сульфату цинку розчиняють у бідистильованій воді, вносять 57,14г саліцилового натрію, доливають водою до 900-950мл. Вимірюють рН, доводять 0,1н розчином їдкого натру до 7,3, після доводять розчин до 1л у мірній колбі бидистиллированной водою.

2) Приготування розчину кальцію хлориду.

2мл офіційного 10% розчину кальцію хлориду (фіксанолу) змішують з 117мл бідистильованої води.

3) Приготування тимолового реактиву.

Спочатку готують 10% розчин тимолу на 96 ° спирті. Потім 1мл спиртового розчину розчиняють у 80мл веронал-медіналового буфера, струшують і доводять до 100мл.

4) Приготування веронал-медіналового буфера.

2,76г вероналу розчиняють у 1-літровій колбі в невеликій кількості бідистильованої води, потім додають 2,06г мединалу, після розчинення визначають рН і доводять вероналом або мединалом до 7,5, розчин доводять до мітки 1л бидистиллированной водою.

5) Приготування цинкового реактиву.

0,28г вероналу, 0,21г мединалу та 0,024г сульфату цинку розчиняють у 1л бідистильованої води, доводять до рН 7,5вероналом або мединалом.

6) Приготування розчину сірчанокислого амонію.

189,0г сірчанокислого амонію і 29,3натрію хлориду розчиняють у 1л бідистильованої води.

7) Приготування молочної сироватки.

Пробу молока центрифугують протягом 15хв при 2000об/хв, ставлять у морозильну камеру холодильника на 20-30хв для застигання жиру. Жир знімають за допомогою шпателя, зняте молоко підігрівають до 37°С і додають оцтову йди солянукислоту по краплях, доводячи рН до 4,6. Казеїн відокремлюють центрифугуванням, а сироватку фільтрують через паперовий фільтр. Доводять рН сироватки до 7,2-7,30,1 н розчином їдкого натру.

8) Побудова калібрувальних кривих.

1)Визначення імуноглобуліну G.

в пробірку № 1 вносять 5 мл цинк саліцилового реактиву, додають 1,1 мл молочної сироватки, витримують 1 хв і колориметрують при довжині хвилі 400-470 мл (синій світлофільтр). У пробірку № 2 вносять 6 мл тимолового реактиву, додають 0,05 мл молочної сироватки і колориметрують при довжині хвилі 400-470 нм (синій світлофільтр).

2)Визначення імуноглобуліну М. У пробірку № 3вносять б мл цинкового реактиву, додають0.05 мл сироватки і колориметрують при довжині хвилі 400-470нм (синій світлофільтр).

3)Визначення імуноглобуліну А.

У пробірку № 4вносять 6 мл розчину сірчанокислого амонію, додають 0,05 мл молочної сироватки і колориметрують при довжині хвилі 400-470 нм (синій світлофільтр

де ДG-оптична щільність імуноглобулінуG;

Д2 -оптична щільність розчину молочної сироватки у пробірці №2;

Д1 -оптична густина розчину молочної сироватки в пробірці № 1;

де Дм -оптична щільність імуноглобуліну;

Дз -оптична густина розчину молочної сироватки в пробірці № 3;

де Да-оптична щільність імуноглобуліну А;

Д4 – оптична щільність розчину молочної сироватки у пробірці № 4;

Калькулятор

Сервіс безкоштовної оцінки вартості роботи

Заповніть заявку. Фахівці розрахують вартість вашої роботи
Розрахунок вартості прийде на пошту та по СМС

Номер вашої заявки

Зараз на пошту прийде автоматичний лист-підтвердження з інформацією про заявку.