Візуальний метод
Мутність екземпляра, рівна 10 МО, орієнтовно відповідає наступним концентраціям інших мікробних клітин в 1 мл (коефіцієнт ):
11∙10 9 клітин/мл для бактерій коклюшної групи;
0,93∙109 клітин/мл для бактерій кишкової групи;
1,7∙10 9 клітин/мл для бруцельозних бактерій;
2,2∙10 9 клітин/мл для холерного вібріона;
5,0∙10 9 клітин/мл для туляремійних бактерій (францисел).
Для екземпляра 5 МО концентрація мікробних клітин в 2 рази менше, ніж для 10 МО.
Для екземпляра 20 МО концентрація мікробних клітин в 2 рази більша, ніж для 10 МО.
У разі, якщо досліджуваний мікроорганізм не зазначений у тексті вище, допускається використання значення концентрації для мікроба, найближчого за розміром до досліджуваного.
Визначення загальної концентрації (ОК) мікробних клітин з використанням СО мутності.Вихідну суспензію мікроорганізмів розводять стерильним 0,9% розчином натрію хлориду доти, поки її каламутність не дорівнюватиме мутності стандартного зразка, що визначають відповідно до інструкції із застосування СО мутності за спеціальною порівняльною таблицею.
Досліджувану мікробну суспензію перемішують струшуванням або піпетуванням в стерильній ємності до гомогенного стану і переносять в пробірку, що входить в комплект з мутності СО, в об'ємі 6-7 мл, що відповідає обсягу рідини в пробірці з СО. Для проведення випробування з використанням ЗІ працюють тільки з пробірками, що постачаються в комплекті з ЗІ мутності.
Перед початком вимірювання стандартний зразок струшують протягом 10-15 секунд до зникнення осаду. Якщо після струшування в пробірці з мутністю СО залишається видимий оком осад, екземпляр вилучають з обігу.
Поєднуютьпробірки з СО каламутності та досліджуваної суспензією мікроорганізмів у вертикальному положенні на рівні очей, щільно прикладають пробірки до порівняльної таблиці і висвітлюють джерелом розсіяного світла таким чином, щоб пробірки не екранували один одного від джерела світла. Джерелом світла можуть бути: люмінесцентна лампа потужністю від 20 до 40 Вт, лампа розжарювання матова або з матовим фільтром (плафоном) потужністю від 40 до 60 Вт, розсіяне денне світло. Випробовувати при прямому сонячному світлі не допускається. У разі однакової чіткості елементів порівняльної таблиці, що проглядаються через пробірку з СО і пробірку з досліджуваної мікробної суспензією, мутність їх вважають однаковою і рівною каламутності, зазначеної на етикетці СО.
Похибка візуального визначення каламутності за допомогою СО каламутності становить близько 10%.
Не допускається залишати екземпляри СО каламутності під дією бактерицидного опромінювача, а також заморожування.
Розрахунок ОК мікробних клітин проводять за формулою:
’
де:V0 - обсяг вихідної суспензії, мл;
Vi – об'єм стерильного 0,9% розчину натрію хлориду, використаного для розведення вихідної суспензії, мл;
k- коефіцієнт: концентрація досліджуваних мікробних клітин у мл, що відповідає 10 МО, КУО/мл.
Приклад визначення загальної концентрації (ОК) мікробних клітин у вакцині туляремійної живої сухої
Визначення проводять, використовуючи не менше трьох зразків.
До 0,5 мл ресуспендованої вакцини (V0 = 0,5 мл) додають стерильний 0,9% розчин натрію хлориду для доведення досліджуваної суспензії до каламутності, що відповідає 10 МО (Vi = 1,0+0,2+0,3 = 1,5мл). Концентрація туляремійних бактерій у суспензії (коефіцієнт k), що відповідає 10 МО, становить 5,0∙10 9ДЕЯ/мл.
Підсумкове значення загальної концентрації мікробних клітин розраховують як середнє арифметичне значень ОК за трьома зразками.
Стандарт каламутності Мак-Фарланда (McFarland)
Іншим прикладом стандартизації за стандартом каламутності мікробної суспензії є використання стандарту Мак-Фарланд (McF). Згідно з інструкцією із застосування, виготовляють 1 % розчини барію хлориду та сірчаної кислоти. Для приготування стандарту каламутності та суспензії мікроорганізмів, що підлягає дослідженню, підбирають пробірки одного діаметра. У пробірки стандарту, що виготовляється, розливають 1 % розчин сірчаної кислоти в обсязі, зазначеному в табл. 1 і додають 1% розчин барію хлориду для отримання загального обсягу 10мл. Пробірки із виготовленим стандартом герметично закривають. Рідина у стандарті Мак-Фарланда та досліджуваній пробірці має бути гомогенно каламутною.
Увага! Барію хлорид та сірчана кислота – отруйні речовини.
Кількісну характеристику досліджуваної мікробної суспензії визначають порівнянням з найближчими пробірками по мутності тим же способом, як при використанні СО мутності з урахуванням даних, наведених у табл. 1. Методика не призначена для визначення загальної концентрації мікробних клітин у бактерійних суспензіях при виробництві та контролі імунобіологічних лікарських препаратів (ІЛП).
Таблиця 1 - Кількісна оцінка бактеріальних суспензій за шкалою Мак-Фарланда