Антибіотики - Глік Молекулярна біотехнологія - Глік Б, Пастернак Дж
Антибіотики
З часу відкриття пеніциліну наприкінці 1920-х років з різних мікроорганізмів було виділено понад 6000 антибіотиків, які мають різну специфічність і різний механізм дії. Їхнє широке застосування для лікування інфекційних захворювань допомогло зберегти мільйони життів. Переважна більшість основних антибіотиків було виділено з грампозитивної ґрунтової бактеріїStrepfotnyces,хоча їх продукують також гриби та інші грампозитивні та грамнегативні бактерії. Щорічно у всьому світі виробляється 100 000 т антибіотиків на суму
258 РОЗДІЛ 12 приблизно 5 млрд. доларів, у тому числі понад 100 млн. доларів припадає на частку антибіотиків, що додаються в корм худобі як добавки або прискорювачі зростання.
За оцінками, щороку вчені виявляють від 100 до 200 нових антибіотиків, передусім у рамках великих дослідницьких програм із пошуку серед тисяч різних мікроорганізмів таких, які синтезували б унікальні антибіотики. Отримання та клінічні випробування нових препаратів обходяться дуже дорого, і у продаж надходять лише ті з них, які мають велику терапевтичну цінність та становлять економічний інтерес. На їхню частку припадає 1—2% всіх антибіотиків, що виявляються. Великий ефект може дати технологія рекомбінантних ДНК. Bo-перше, з її допомогою можна створювати нові антибіотики з унікальною структурою, що мають більш потужний вплив на певні мікроорганізми і мають мінімальні побічні ефекти. По-друге, генноінженерні підходи можуть використовуватися для збільшення виходу антибіотиків і відповіднозниження вартості їхнього виробництва.
При створенні рекомбінантних штамівStreptomyces—основного мікроорганізму, що використовується для отримання антибіотиків, важливо пам'ятати, що трансформація та відбір трансформованих клітин не повинні бути надто складними. Однак на відміну відЕ.coliStreptomycesіснують не у вигляді ізольованих клітин, а у вигляді протяжних міцел, тому перед трансформацією необхідно зруйнувати клітинну стінку та вивільнити окремі протопласти (рис. 12.9). Без цього буде неможливо відрізнити трансформовані клітини від нетрансформованих, оскільки видимі колонії на твердому середовищі утворюватимуться з групи клітин, а не з індивідуальної клітини; відповідно колонії, що ростуть у присутності селективного антибіотика, будуть сумішшю трансформованих і нетрансформованих клітин. Проникнення плазмідної ДНК у протопластиStreptomycesполегшується в присутності поліетиленгліколю. Після трансформації протопласти спочатку висівають на тверде середовище, щоб утворилося.
клітинна стінка, а потім для відбору трансформованих клітин переносять на селективне середовище, що зазвичай містить або неоміцин, або тіострептон.
 | Мал. 12.9. Схема трансформації та відбору рекомбінантних штамівSireptvmycea.Трансформовані клітини позначені рожевими кружками, нетрансформовані - зеленими. ПЕГ - поліетиленгліколь. |
Використання рекомбінантних мікроорганізмів для отримання комерційних продуктів 259
Клонування генів біосинтезу антибіотиків
Процес біосинтезу одного антибіотика може складатися з 10-30 ферментативних реакцій, так що клонування всіх генів його біосинтезу – завдання не з легких. Один із підходів довиділення повного набору таких генів заснований на трансформації одного або кількох мутантних штамів, не здатних синтезувати цей антибіотик, банком клонів, створеним із хромосомної ДНК. штаму дикого типу. Після введення банку клонів до мутантних клітин проводять відбір трансформантів, здатних синтезувати антибіотик. Потім виділяють плазмідну ДНК клону, що містить функціональний ген антибіотика, що експресується, [т. е. ген, що відновлює (комплементуючий) втрачену мутантним штамом функцію], і використовують її як зонд для скринінгу іншого банку клонів хромосомної ДНК штаму дикого типу, з якого відбирають клони, що містять нуклеотидні послідовності, які перекриваються з послідовністю. Таким чином, ідентифікують, а потім клонують елементи ДНК, що примикають до комплементуючої послідовності, та відтворюють повний кластер генів біосинтезу антибіотика. Описана процедура стосується випадку, коли ці гени згруповані в одному сайті хромосомної ДНК. Якщо ж гени біосинтезу розкидані у вигляді невеликих кластерів по різних сайтах, потрібно мати принаймні по одному мутанту на кластер, щоб отримати клони ДНК, за допомогою яких можна ідентифікувати інші гени кластерів.
Цей підхід з успіхом використовувався для ідентифікації деяких генів біосинтезу ундецилпродігіозину з Streptomycescoelicolor A3 (рис. 12.10). У цьому випадку комплементаційний аналіз ґрунтується на порівнянні кольору колоній: колонії мікроорганізмів дикого типу мають червоний колір, а колонії мутант кремовий. Таким чином, у результаті комплементації утворюється червона колонія.
Крім комплементації, для ідентифікації генів біосинтезу антибіотиків можуть використовуватися більш прямі підходи. Так, з
| Мал. 12.10. Структурна формула ундецилпродігіозину. |
За допомогою генетичних або біохімічних експериментів можна ідентифікувати, а потім виділити один або кілька ключових ферментів біосинтезу, визначити їх N-кінцеві амінокислотні послідовності та, виходячи з цих даних, синтезувати олігонуклеотидні зонди. Цей підхід використовувався для виділення зPenicilliumchrysogenutnгена синтетази ізопеніциліну N. Цей фермент каталізує окислювальну конденсацію δ-(L-α-аміноадипіл)-L-цистеїніл-D-валіну в ізопеніцилін N , ключова проміжна ланка в біосинтезі пеніцилінів, цефалоспоринів та цефаміцинів (рис. 12.11)
Синтез нових антибіотиків
Нові антибіотики з унікальними властивостями та специфічністю можна отримати, проводячи генноінженерні маніпуляції з генами, що беруть участь у біосинтезі вже відомих антибіотиків. Один з перших експериментів, в ході якого був отриманий новий антибіотик, полягав в об'єднанні в одному мікроорганізмі двох шляхів біосинтезу антибіотика, що трохи різняться.
Одна з плазмідStreptomyces,рIJ2303, що несе фрагмент хромосомної ДНКS. coelicolorдовжиною 32,5 т.п.н., містить усі гени ферментів, відповідальних за біосинтез з ацетату антибіотика актинородину, представника сімейства ізохроманхінонових антибіотиків (рис. 12.12). Цілу плазміду та різні субклони, що несуть частини 32,5 т.п.н.-фрагменту (наприклад, рIJ2315), вводили або в штам АМ-7161Streptomycessp., що синтезує споріднений антибіотик медерміцин, або в штам В1140 або T22S. violaceoruber,синтезують споріднені антибіотики гранатицин та дигідрогранатицин.
Усі зазначені антибіотики є кислотно-лужними індикаторами,які при-
 | Мал. 12.11. Біосинтез леніцилінів і цефалоспоринів уP.chrysogenum.Синтетаза ізопеніциліну N каталізує синтез з δ-(L-α-аміноаліліл)-L-цистеїніл-D-валіну ізопеніциліну N — попередника пеніциліну G , пеніциліну N та цефалоспорину С. |
У структурному відношенні ці нові антибіотики мало відрізняються від актинородину, медерміцину, гранатицину та гідрогранатицину і, ймовірно, утворюються в тому випадку, коли проміжний продукт одного шляху біосинтезу служить субстратом для ферменту іншого шляху. Коли будуть детально вивчені біохімічні властивості різних шляхів біосинтезу антибіотиків, з'явиться можливість створювати нові унікальні високоспецифічні антибіотики.маніпулюючи генами, що кодують відповідні ферменти.
Розробка нових методів отримання полікетидних антибіотиків
Термін «полікетидні» відноситься до класу антибіотиків, які утворюються в результаті.
Використання рекомбінантних мікроорганізмів для отримання комерційних продуктів 261