| Пріоритети: | Винахід відноситься до нових біологічно активних сполук, а саме до диглікопептиду гліциризинової кислоти з метиловим ефіром L-валіну формули (I), що стимулює первинну імунну відповідь.
З'єднання, що заявляється, є помірно небезпечною речовиною і стимулює вироблення антитілоутворюючих клітин в 2 рази в порівнянні з контролем. 1 табл.
Винахід відноситься до нових біологічно активних сполук, безпосередньо до диглікопептиду гліциризинової кислоти з метиловим ефіром L-валіну формули (I), що стимулює первинну імунну відповідь.
Зазначене з'єднання та його властивості у літературі не описані.
Завдання, на вирішення якого направлено заявлене технічне рішення, полягає в пошуку нових сполук у ряді похідних гліциризинової кислоти (ГК), що мають імуностимулюючу активність. У заявленому технічному рішенні синтезовано нову хімічну сполуку - диглікопептид ГК зметиловим ефіром L-валіну формули (I), що стимулює первинну імунну відповідь (вироблення антитілоутворюючих клітин, АОК).
Спосіб отримання пропонованої сполуки (1) полягає в тому, що ГК (II) обробляють N-гідроксисукцинімідом (HOSu) і N 1 N 1 -дициклогексилкарбодиимидом (ДСС) у діоксані при 0 - +5С протягом 3 год при мольному співвідношенні реактивів ГК: HOSu: ДСС=1:4:2 ммоль, витримують 8-10 год у холодильнику при +4 - +8С, відфільтровують осад дііклогексилсечовини, а до фільтрату додають 2,5-2,7 ммоль гідрохлориду метилового ефіру L-валіну та надлишок третинного основи (триетиламіну) (1 мл). Суміш витримують при 20-22°С, з періодичним перемішуванням протягом 15-20 годин, розбавляють холодною водою, підкислюють лимонною кислотою до рН-4, осад фільтрують і сушать. Очищення продукту проводять хроматографією на силікагелі L (40/100 мкм, Чехія), елююючи сумішшю СHCl 3 -MeOH-H 2 O, 200:10:1, 100:10:1 (50:10:1) (V%). Вихід диглікопептиду (I) становив 60%.
Гостра токсичність диглікопептиду (I) визначалася на білих безпородних мишах обох статей масою 18-20 г при одноразовому внутрішньочеревному введенні. Параметри токсичності обчислювалися за Літчфільд і Вілкоксона [Біленький М.Л. Елементи кількісної оцінки фармакологічного ефекту (2-ге вид., перероб. і доп.). Ленінград, 1963. С.152].
Гостра токсичність (LD 50 ) становила 1100 мг/кг. Ця сполука належить до 3-го класу помірно-небезпечних речовин [Біленький М.Л. Елементи кількісної оцінки фармакологічного ефекту (2-ге вид., перероб. і доп.). Ленінград, 1963. С.152].
Вплив диглікопептиду (I) на первинну імунну відповідь вивчали на безпородних мишах масою 18-20 г за методом Ерне та Нордіна [Jerne N.K., Nordin E.A. Plaque formation in by single antibody-producing cells.//Science.1963. V.140. P.405] у модифікації Каннінгема [Cunningham A.J., Czenberg A. Further improvement в plaque technique for detecting single antibody forming cell.//Immunology. 1968. No. 2. P. 599]. Тварин імунізували внутрішньочеревним введенням 5% суспензії еритроцитів барана, через 24 години після імунізації внутрішньочеревно вводили глікопептид (I) у дозі 2 мг/кг. Про дію досліджуваної сполуки на гуморальну ланку імунітету судили за кількістю антитілоутворюючих клітин (АОК) у всій селезінці, яку візуально підраховували за кількістю зон гемолізу, потім проводили перерахунок АОК на 10 6 спленоцитів. Як препарат порівняння використовували відомий імуностимулятор класу глікопептидів, N-ацетилмурамоїлдипептид (МДП), у дозі 2 мг/кг [Л.А. Балтіна, Г.А. Товстиків. Мурамілпептиди. Єкатеринбург: УРО РАН, 1998. 348 с.]. Результати дослідів представлені у таблиці.
Встановлено, що при внутрішньочеревному введенні диглікопептид (I) збільшує кількість АОК у селезінці у мишей у дозі 2 мг/кг.
у 2 рази порівняно з контролем. Диглікопептид (I) стимулює гуморальну ланку імунної відповіді ефективніше за референс-препарат МДП при введенні в рівних дозах.
Вплив глікопептиду (I) на вироблення АОК у безпородних мишей
На відміну від МДП, з'єднання (I) менш токсичне. LD 50 МДП=1000 мкг/миша [Джексенбаєв О.Ш. Біологічні властивості синтетичних глікопептидів-стимуляторів імуногенезу неспецифічної резистентності.//Жур. мікробіол., епідеміол., імунол. 1981. №8. С.13]. LD 50 для глікопептиду (I) 1100 (7851540) мг/кг (внутрішньочеревно, миші), ця сполука відноситься до III класу помірно небезпечних речовин.
Сутність винаходу ілюструється наведеними нижче прикладами.
Приклад 1. Вплив сполуки (I) на первинну відповідь вивчали на 24безпородних білих мишах масою 18-20 г за методом Ерне та Нордіна [Jerne N.K., Nordin E.A. Plaque formation in afar by single antibody-producing cells.//Science. 1963. V.140. P.405] у модифікації Каннінгема [Cunningham A.J., Czenberg A. Further improvement в plaque technique for detecting single antibody forming cell. // Immunology. 1968. No. 2. P.599]. Тварин імунізували 5% суспензією еритроцитів барана (ЕБ) внутрішньочеревно за 4 доби до досвіду. Через добу після імунізації тваринам внутрішньочеревно одноразово вводили сполуку (I) у дозі 2 мг/кг. Через 4 доби (на 5-ту) визначали кількість АОК у всій селезінці. Після інкубації в термостаті при t=37°С протягом 2,5 год візуально підраховували число зон гемолізу, відповідне кількості АОК, і проводили перерахунок АОК на 10 6 спленоцитів.
Дія диглікопептиду (I) порівнювали з впливом МДП на вироблення АОК (див. табл.) при введенні дози 2 мг/кг.
На безпородних мишах диглікопептид (I) у дозі 2 мг/кг збільшує кількість АОК порівняно з контролем у 2 рази. Імуностимулюючий ефект сполуки (I), що заявляється, більш виражений, ніж у МДП.
Приклад 2. 3-0-[2-0-N-(-D-глюкопіранозілуроноїл)-L-валіну метиловий ефір]-[N-(-D-глюкопіранозилуроноїл)-L-валіну метиловий ефір]-3,20)- 11-оксо-30-норолеан-12-ен-3-іл-30-карбонова кислота (I).
До розчину 0,82 г (1 ммоль) глізирризинової кислоти в 50 мл діоксану при 0 - +5С додали при перемішуванні 0,46 г (4 ммоль) N-гідроксисукциніміду і перемішували при цій температурі 3 год, витримували протягом ночі в холодильнику при +4-+8С. Відфільтрували осад дициклогексилсечовини та до фільтрату, охолодженого до 0 - +5С, додали 0,45 г (2,7 ммоль) гідрохлориду метилового ефіру L-валіну та 0,5 мл (4,9 ммоль) триетиламіну.
Суміш перемішували при20-22С 20 год, розбавили холодною водою, підкислили лимонною кислотою до рН
4 осад відфільтрували і промили водою. Сухий осад (1,0 г) хроматографували на колонці з силікагелем L (40/100 мкм), елююючи сумішшю СНС1 3 -МеОН-Н 2 О=200:0:1, 100:10:1, 50:10:1 ( V%). Вихід 60% (білий порошок). [] 20 D + 32 (з 0,04; МеОН). ІЧ-спектр, см -1 : 3600-3200 (ВІН, NH); 1740 (СООМ); 1660 (З II = 0); 154 = (CONH). УФ-спектр, max МеОН (lg): 250 нм (4,95). Знайдено, %: N 2,72 C 54 H 84 N 2 O 18 . Розраховано, %: N 2,67. спектр ЯМР 13 С (CD 3 OD, 25С, 75,5 МГц, 8, м.д.): 40,5 (С1); 90,6 (С3); 56,7 (С5); 34,1 (С7); 63,4 (С9); 202,9 (С11); 129,2 (С12); 171,7 (С13); 46,8 (С14); 28,7 (С16); 48,4 (С18); 45,2 (С20); 39,3 (С22); 29,0 (С23); 17,2 (С24); 17,5 (С25); 19,2 (С26); 24,1 (С27); 29,2 (С28); 29,5 (С29); 180,8 (С30); 105,2 (С1'); 81,8 (С2'); 76,3 (С3'); 73,7 (С4'); 78,0 (С5'); 171,7 (С6'); 105,2 (С1”); 76,1 (С2”); 76,5 (С3”); 73,6 (С4”); 77,3 (С5”); 171,7 (С6”). Фрагменти амінокислот: С1: 53,04; 52,93; С2: 173,36; 173,17; С3: 59,29; 58,70; С4: 32,55; С5: 19,73; 19,61.
Таким чином, з'єднання (1), що заявляється, є помірно небезпечною речовиною, що стимулює вироблення АОК в 2 рази в порівнянні з контролем. Імуностимулюючий ефект глікопептиду (I) більш виражений, ніж у МДП.
ФОРМУЛА ВИНАХОДУ
Диглікопептид гліциризинової кислоти з метиловим ефіром L-валіну загальної формули (I)
