Ферментація (культивування)
Культивування – найважливіший та тривалий етап біотехнологічного виробництва. Ферментація являє собою сукупність послідовних операцій від внесення в заздалегідь приготовлену та термостатовану живильне середовище посівного матеріалу до завершення процесів росту та біосинтезу внаслідок вичерпування поживних речовин середовища. Існує два основних типи ферментацій: одержання біомаси мікроорганізмів та одержання цінних речовин (метаболітів), що виникають у ході зростання або на наступних стадіях розвитку культури.
Для культивування мікроорганізмів у промислових масштабах застосовують ферментери (або ферментатори) - реакційні ємності, в яких за певних умов знаходяться мікроорганізми. Основне призначення ферментатора – своєчасно забезпечити мікробні клітини необхідними поживними речовинами та киснем (при необхідності) та відвести продукти обміну речовин, створити однорідний склад середовища за умови слабкого потоку культуральної рідини (при безперервному культивуванні).
Незалежно від способу культивування перед заповненням ферментаторів середовищем їх миють, перевіряють на герметичність, стерилізують гарячою парою як сам ферментатор, так і систему трубопроводів. Для забезпечення стерильності ферментатора часто застосовують попередню обробку його хімічними речовинами, що дезінфікують (цей процес проводять безпосередньо перед обробкою гарячою парою). Після цього його заповнюють стерильним охолодженим живильним середовищем. Кількість середовища у ферментаторі має перевищувати 70 % його загального обсягу. Потім по лінії посівного матеріалу за допомогою стерильного повітря ферментатор вводять посівний матеріал. Вже перед його подачею температура і рН живильного середовища повинні бути доведені до оптимальних значеньданої культури. Відповідно регулюють інтенсивність аерації та перемішування середовища. У просторі над рідиною зазвичай накопичується піна. Якщо її шар сильно збільшується, то апарат вводяться хімічні піногасники. Під час ферментації автоматично регулюється температура та рН середовища, у разі потреби додають розчини кислоти або лугу. За спеціальним графіком беруть зразки рідини з ферментатора для біохімічного та мікробіологічного контролю.
Ферментацію припиняють, як у середовищі накопичується максимальну кількість корисного продукту. Кінець ферментації можна визначити і мікробіологічно за морфологічними змінами клітин продуцента.
Закінчивши ферментацію, культуральну рідину охолоджують до 10 –15 °З повагою та перекачують у резервуари, у тому числі вона поступово подається на подальшу обробку.
Виділення цільового продукту
Стадія виділення продукту істотно залежить від того, накопичується продукт у клітинах або він виділяється в культуральну рідину, або продуктом є сама клітинна маса. Розподіл біомаси та культуральної рідини – сепарація здійснюється кількома методами.
Виділення біомаси. Якщо цільовим продуктом є біомаса клітин, застосовують такі методи виділення: відстоювання, фільтрація, флотування, сепарування і т.д. (механічні методи); випарювання та сушіння (фізичні способи).
Фільтрація– простий і широко застосовуваний процес поділу твердих частинок та рідини, швидкість якого залежить від пористості фільтруючого матеріалу та тиску. Фільтрування за допомогою вакуумних насосів значно прискорює процес.
Флотуваннязастосовно виділення дріжджових клітин. Процес флотування клітин здійснюється шляхомспінювання культуральної рідини. Разом з піною з культуральної рідини видаляється й переважна більшість дріжджів.
Сепаруванняздійснюють у сепараторах, в яких на клітини діє відцентрова сила, що відкидає клітини до периферії судини, а культуральна рідина буде збиратися в центрі сепаратора. Цей процес протікає набагато швидше, ніж відстоювання клітин під дією сили тяжіння.
Вилучення цільового продукту з клітин. Якщо цільовий продукт міститься в самих клітинах, то проводять руйнування клітин -дезінтеграцію- фізичними, хімічними та ферментативними методами.
Дофізичнихметодів можна віднести руйнування клітин під дію ультразвуку, заморожування-відтавання, балістичну дезінтеграцію. Балістична дезінтеграція клітин здійснюється в млинах, куди поміщають суспензію клітин і допоміжні речовини, що мелють: пісок, скляні або полімерні кульки.
Дохімічнихметодів дезінтеграції відносять руйнування клітин за допомогою толуолу, бутанолу та інших хімічних сполук.
При використанніферментативноїдезінтеграції клітин використовують ферменти, здатні руйнувати певні структурні компоненти клітинних стінок мікроорганізмів. Наприклад, для руйнування бактеріальних клітин застосовують лізоцими яєць, бактерій, актиноміцетів чи грибів. Для руйнування дріжджів та цвілевих грибів використовуються фосфоманназа та бета-глюконаза або застосовують автоліз.Автоліз– руйнування клітин дріжджів чи цвілевих грибів під впливом власних гідролітичних ферментів. Для цього суспензію клітин інкубують при 35 - 45 ˚С.
Виділення продукту з культуральної рідиниабо гомогенату зруйнованих клітин проводять шляхом його осадження, екстракції, кристалізації абосорбції.
У найбільш простому випадку всю культуральну рідину можна використовувати як готовий продукт, наприклад при отриманні бактеріальних добрив, якщо їх застосовують в рідкому вигляді. У спиртовій промисловості амілолітичні ферменти цвілевих грибів іноді використовують у рідкому вигляді. При виробництві вітамінних та амінокислотних концентратів для потреб тваринництва іноді використовуються всі продукти ферментації. У таких випадках культуральну рідину упарюють у вакуум-апаратах і сушать у сушарках розпилювального типу.
Осадження у вигляді нерозчинних солей виробляють шляхом додавання хімічного осадника в еквімолярних кількостях. Застосовують при отриманні лимонної, молочної кислоти.
Екстракція- додавання до розчину екстрагенту (розчинника), який поглинає цільовий продукт. Потім емульсію поділяють та виділяють цільову речовину. Використовують для отримання вітамінів, антибіотиків.
Кристалізація– після попередньої обробки культуральної рідини та випарювання при охолодженні здійснюють кристалізацію. Даний метод виділення та очищення використовується при отриманні глутамінової, ітаконової та інших кислот.
Потім виділений продукт концентрують центрифугуванням, ультрафільтрацією, випарюванням або зворотним осмосом.
Центрифугування– розшарування розчину з частинками більшої щільності на осад і надосадову рідину при дії відцентрової сили.
Ультрафільтрація– обробка розчину на мембранних фільтрах з певним розміром часу (тобто поділ речовин на фракції за розмірами їх молекул). Застосовується для ферментів та інших білків.
Очищення цільового продукту
Ця стадія необхідна при отриманні очищеного цільового продукту, наприклад, ферментнихпрепаратів ступеня очищення більш ніж дворазовий. Ця стадія призводить до зростання собівартості одержуваного цільового продукту. Для проведення процесівіонообміну, перегонки, ректифікації, випарювання, кристалізаціїта інших у мікробіологічному виробництві застосовують обладнання хімічної технології.
Для очищення ферментів застосовують вибіркову сорбцію (зв'язування) каоліном, трифосфатом кальцію, гідроксидом алюмінію та іншими адсорбентами. Таким чином проводять сорбцію або ферменту, або баластних білків, які потім розділяють центрифугуванням. Фермент із сорбенту відокремлюють розчином фосфатного буфера.
На останньому етапі продукт відокремлюють від домішок, концентрують та стабілізують. Після стабілізації продукту залежно від того, яким має бути кінцевий продукт: сухим або рідким, його зневоднюють або одразу упаковують і відправляють на зберігання і далі споживачеві.
ПИТАННЯ ДЛЯ САМОКОНТРОЛЮ:
1. Перелічіть основні стадії біотехнологічного виробництва.
2. Що таке посівний матеріал?
3. Як готують посівний матеріал у виробничих умовах?
4. Які компоненти входять до складу живильних середовищ?
5. Що таке ферментація?
6. Якими методами здійснюється поділ біомаси від культуральної рідини?
7. Перерахуйте основні стадії біотехнологічної схеми одержання продуктів мікробного синтезу.
8. Як визначити фізіологічні потреби мікроорганізмів у поживних речовинах?
9. Які методи застосовують для знезараження поживних середовищ у біотехнологічному виробництві?
10. Опишіть послідовність одержання посівного матеріалу для промислового виробництва цільового продукту.
11. Основне призначення ферментера.
12.Чому залежить проведення стадії виділення цільового продукту?
13. Які методи застосовують для відокремлення біомаси клітин від культуральної рідини?
14. Що таке дезінтеграція, у яких випадках її здійснюють?
15. Розкажіть про основні методи дезінтеграції клітин.
16. У чому відмінність сепарування від центрифугування?
17. У яких випадках виконується стадія чищення цільового продукту?
18. Що таке сорбція?
Чи не знайшли те, що шукали? Скористайтеся пошуком гугл на сайті: