Флуориметрія. Розділ із ненаписаного підручника агронома
Отже, ми поринаємо в методику, яка тільки виникає для практичного застосування в полях: у вас є проблема, рослини слабкі, їхня кондиція нижча за норму. Ви берете в руки – точніше, в руку, він поміщається в одній руці, – флуориметр і протягом кількох хвилин отримуєте відповідь, у чому ваша проблема полягає. І, можливо, все ще можна виправити.
Давайте розглянемо механізм цього докладніше.
Два типи приладів для миттєвого аналізу стану рослин
Флуореценція хлорофілу: корисний (практичний) інструмент
Department of Plant Physiology, Warsaw Agricultural University SGGW Переклад з англійської - Н.А. Уляницька
Продовжуємо наше знайомство із флуориметрією. Метод, визначальний фотосинтетичну активність рослини, отже, і майбутню його врожайність, дуже простий у теорії, у розумінні, але дуже простий у застосуванні. Його головні переваги - простота та швидкість. Вам не потрібно відбирати зразки на полі, виривати рослини або його частини, їхати в лабораторію.
Весь найскладніший аналіз може проводити будь-яка людина на полі. І часу займає зовсім небагато: один типовий вимір триває одну секунду, але забезпечує масу інформації. Якось не одразу віриться, правда? Що за такий короткий термін може вловити прилад?
Флуориметр, робота якого заснована на вимірюванні інтенсивності флуоресценції (відсвічування) хлорофілу, фіксує інтенсивність не постійної, а короткочасної флуоресценції, яка спостерігається, коли рослина інтенсивно висвітлюється після затемнення. Така швидкість одержання результату дозволяє обстежити сотні рослин за годину. Багато селекціонерів вже застосовували цей спосіб у своїх дослідженнях як критерій селекційногодобору і підтвердили, що він забезпечує достовірну інформацію про фотосинтез, який має пряме відношення до кінцевого врожаю культур. Крім інтенсивності відсвічування хлорофілу, флуориметр фіксує багато інших параметрів, які можуть використовуватися як додаткові або перевірочні, надійні індикатори. Мета статті – розповісти про ці параметри, щоб ви вміло використовували отримані знання для досягнення своїх цілей.
Вимірювання флуоресценції хлорофілу
Хлорофіл – зелений пігмент рослин – безпосередньо бере участь у кількох фізіологічних процесах. Вивчаючи його флуоресценцію, ми побічно вивчаємо інші рівні фотосинтезу (наприклад, процеси лише на рівні пігментів, первинні світлові реакції тилакоїдів, реакції руху електронів, темнові ферментні реакції, повільні регуляторні процеси). Ці показники часто визначальні для фізіологічного стану рослин. Прояв впливу стресових умов у рослин відбувається на тому етапі, коли більшість фізіологічних процесів вже необоротні. У попередній статті неодноразово згадувалося, що фотосинтез - найкращий індикатор визначення стану рослини на рівні клітин. Справа в тому, що процес фотосинтезу часто уповільнюється в рослинах, що піддаються впливу навіть короткочасних несприятливих умов - дефіцит води, температура, нестача поживних речовин, конкуренція бур'янів, проникнення збудників хвороб (Araus та ін, 1998). Отже, аналіз параметрів флуоресценції хлорофілу вважається важливим методом для оцінки здоров'я, внутрішньої цілісності рослини в межах надземної частини культури (Krause та Weiss, 1991; Clark та ін., 2000). Це також швидкий і точний спосіб діагностики та визначення ступеня стійкості рослини до несприятливих абостресовим умовам (Li та ін., 2006). Більш того, новий напрямок у фізіології рослин (що вивчає нейронний міжклітинний зв'язок) показало, що вимірювання інтенсивності флуоресценції хлорофілу - це один з найбільш перспективних методів для визначення (ідентифікації) виду рослин і може також застосовуватися для визначення стану рослин без наявності будь-якої первинної інформації (Codrea та ін., 2003). Формування за допомогою флуориметрів зображення кривої інтенсивності флуоресценції хлорофілу допоможе зрозуміти зміни, що відбуваються в рослині (Lawson та ін., 2002; Moya та Cerovic, 200).
Флуоресценція хлорофілу – явище не дуже складне. Його суть полягає у здатності зеленого пігменту – хлорофілу – поглинати, а потім випромінювати (відсвічувати) світлову енергію та довгі хвилі світла. Тривалість такого випромінювання хлорофілом визначається двома факторами: кількістю світла, поглиненого рослиною, та рівнем конкуренції за світлову енергію з іншими енергетичними процесами, що відбуваються у рослині (в основному це процеси утворення нових речовин та віддачі тепла в рослині). Якщо хлорофіл починає менше поглинати світла, це означає, що його конкуренти отримують світлової енергії більше. Отже, зміни в інтенсивності флуоресценції відображають зміни в ефективності утворення нових речовин – майбутнього нашого врожаю (Hnstch, 2007). Схематично це можна показати в такий спосіб (рис. 1). Протягом останніх десятиліть розвиток електроніки сприяв появі доступних багатьом приладів для вимірювання сигналів флуоресценції хлорофілу з будь-якої частини рослини, де відбувається фотосинтез. Ознайомимося з ними детальніше.
Тип перший - прибр тривалої індукції (стимуляції) хлорофілу
Флуориметр тривалийСтимуляція призначена для вимірювання інтенсивності світіння хлорофілу, яке виникає після короткочасної відсутності світла. Фізіологи називають цей процес швидкою індукцією флуоресценції або індукцією Каутського - на ім'я вченого, який досліджував дане явище ще в 1931 (Kautsky і Hirsch, 1931). Раніше для вивчення зразка рослини закривали спеціальним екраном, що не пропускає довгі (червоні) хвилі світла. Дослідження проводились у кімнаті, обладнаній спеціальними лампами зеленого світла, після кількох хвилин перебування рослин у темряві. Тепер за допомогою флуориметрів вимірювання можна проводити в полі, приєднавши датчики-затискачі до будь-якої (що вас цікавить) зеленої надземної частини рослини. На екрані флуориметра з'являються різні цифри, літери, графіки, які, на перший погляд, про рослину нічого не розповідають (рис. 2).
Але це лише на перший погляд. Виявляється, за допомогою такого флуориметра ми можемо виміряти кілька метричних показників.
Перший показник – рівень (інтенсивності) виділення світлових хвиль хлорофілом – позначається символом Fo.
Параметр Fo показує, скільки поглиненого раніше світла виділяють молекули хлорофілу. Для фіксування цього рівня необхідно, щоб у клітинах рослини відбулася складна реакція - окислення першого стабільного електронного акцептора фотосистеми, названого Qa. Іншими словами, необхідно, щоб ті молекули, які в клітинах рослини приймають світлові хвилі, з'єдналися з молекулами кисню і почали передавати світлову енергію до інших молекул клітини, які почнуть світло випромінювати з клітини. (Всі знайомі з подібним явищем – пам'ятайте, як світяться у темряві прилади, іграшки, брелоки від ключів тощо, що мають у своєму складі білий фосфор. Принцип урослині такий же.) Реакція окислення відбувається миттєво, навіть швидше, ніж ви читаєте ці рядки, - кілька наносекунд (одна мільярдна секунди). І все фіксує флуориметр, що підтверджує його чутливість. Інтенсивність Fo змінюється у часі.
Другий показник – максимальний рівень випромінювання світла хлорофілом – позначається символами Fp або Fm.
Це параметр, який показує максимальний рівень флуоресценції за певний час. На приладі він позначається одним із символів: Fp або Fm. Чому так? Все дуже просто. Залежно від часу виміру, молекули, які приймають хвилі світла, встигають або ж, навпаки, не встигають повністю з'єднатися з киснем. Якщо молекули встигли поглинути всі необхідні хвилі світла і повністю з'єднатися з молекулами кисню, то на екрані з'являється символ Еш, максимально можливий рівень флуоресценції хлорофілу, що вивчається рослини. Якщо на момент проведення вимірювання не дуже сонячна погода або інтенсивність світла недостатньо висока і рослина не може повністю насичуватися киснем протягом всього вимірювання, то на екрані приладу з'являється значення Ер, максимальна інтенсивність флуоресценції за період вимірювання.
Третій показник – Fv.
Параметр Fv - тимчасова величина і обчислюється флуориметр як різниця між першими двома показниками, тобто від рівня флуоресценції хлорофілу рослини віднімається максимально можливий рівень флуоресценції хлорофілу.
Четвертий показник – співвідношення Fv/Fm.
Fv/Fm – параметр, який широко використовується, щоб оцінити максимальний рівень фотосинтезу для цієї рослини. Наочно демонструє наявність стресу у рослині. Яким чином? Здорові рослини, що не піддаються стресу,Оптимальні умови, як правило, мають співвідношення Fv/Fm приблизно 0,85. Якщо цей показник менший – рослина зазнає негативного впливу зовнішніх факторів. За цим показником можна оцінити рівень стресу.
П'ятий показник – Тfm.
Тfm - параметр, який показує час, протягом якого досягнуто максимальний рівень флуоресценції (Fm). Якщо рослина перебуває у стресових умовах - показник Тfm нижчий за оптимальний час.
Шостий показник – індексу продуктивності рослини – Р1.
Індекс продуктивності (Р1) – це, по суті, індикатор життєздатності рослини. Він є загальним показником стійкості рослини до впливу негативних умов (несприятливих, що обмежують) довкілля. Показує, наскільки рослини культури самостійно можуть упоратися зі стресом, змінюючи чи зберігаючи свою продуктивність.
Флуориметри, що працюють за принципом вимірювання інтенсивності короткочасної флуоресценції хлорофілу, називаються "вимірювачі впливу стресу на рослину". Зазвичай ці прилади портативні, легкі та з програмним забезпеченням для подальшого аналізу отриманих параметрів. Як приклад – кишеньковий флуориметр хлорофілу РЕА (фото 1).
Другий тип - прилад із системою модулювання світлового сигналу (імпульсу)
Одна з найбільш значних переваг таких флуориметрів – можливість проводити обстеження рослин у будь-яких погодних умовах безпосередньо на полі. Прилад фіксує показники флуоресценції хлорофілу в оптимальному природному для рослини освітленні, а якщо освітлення недостатньо - самостійно моделює необхідний сигнал-імпульс, який замінює необхідний рівень освітлення. За допомогою таких флуориметрів можна змоделювати максимально можливу продуктивність культуриіснуючих умовах вашого поля. Крім показників інтенсивності флуоресценції хлорофілу, продуктивності рослин, флуориметр фіксує та інші показники. Типовий приклад показано на рис.3.
Fo – рівень флуоресценції рослини.
Fm – максимально можливий для обстежуваного зразка рослин рівень фотосинтезу.
F - рівень флуоресценції, що спостерігається у будь-який час світлового дня.
F'm – максимальний рівень флуоресценції за наявності світла.
F'o – мінімальний рівень флуоресценції рослиною за відсутності світла.
ML – кількість світла.
SP – рівень насичення рослини світловими хвилями.
AL – рівень світла, що використовується у фотосинтезі.
FR - далеке червоне світло, що не бере участі у фотосинтезі (van Kooten та Snel, 1990).
Прилади для вимірювання флуоресценції такого типу хлорофілу називаються флуориметрами з системою модулювання світлового сигналу. Типовим прикладом є флуориметр хлорофілу FMS-2 (основне фото статті).
Що можуть визначити флуориметри?
Згідно Strasser та ін (2000), є чотири основні групи питань, на які можна відповісти, використовуючи флуориметри.
1-й тип – наявність хімічного стресу.
Існують стабільні показники рівнів фотосинтезу за певних умов: вплив впливу хімічних речовин алелепатії (виділення інших рослин - культури чи бур'янів), гербіцидів, регуляторів росту, добрив, СО2, О2, SO2 чи інших газів тощо.
2-й тип – наявність фізичного стресу.
Флуориметр порівнює показники зі стабільними величинами у різних умовах інтенсивності світла чи температури.
3-й тип - наявність змішаного хімічного та фізичного стресів.
4-й тип – біообстеження.Проводяться постійно з певним інтервалом часу, щоб:
- вивчити реакцію рослин (або навіть рослинного співтовариства) у часі з погляду його життєздатності, продуктивності та реакції на стрес;
- вивчити зв'язку структура-функція на трансгенних рослинах.
Як точно зазначив канадський вчений біоінженер Strasser, флуориметри - унікальні прилади, що дозволяють визначати безліч біологічних показників не лише вченим, а й кожній зацікавленій людині. За допомогою флуориметра можна отримати інформацію – починаючи з визначення сільськогосподарської продуктивності рослин кожної культури з урахуванням впливу типу землеробства, гербіцидів, пестицидів, регуляторів росту, сортів, факторів навколишнього середовища, які можуть спричинити стрес та закінчуючи дослідженням впливу глобальних кліматичних змін.
Швидко, просто та доступно
Для детальної картини та закріплення знань вам, читачу, будуть запропоновані ще п'ять статей з докладними теоретичними викладками та практичними інструкціями щодо використання флуориметрії та флуориметрів у практиці агробізнесу.