Фосфодіестераза - Біологія
У припиненні сигналу цАМФ беруть участь фосфодіестераза, що гідролізує цей нуклеотид до АМФ. На противагу аденілатциклазі фосфодіестераза – переважно розчинний фермент. У той же час активність ферменту виявлена у фракціях саркоплазматичного ретикулуму, мітохондрій та ядер.
Циклонуклеотидактивована фосфодіестераза гідролізує як цАМФ, так і цГМФ, при цьому під дією цГМФ прискорюється гідроліз цАМФ і навпаки, що свідчить про позитивну кооперативність двох активних центрів. Безперечна роль ферменту у проведенні нервового імпульсу: так, у постсинаптичній мембрані нервової тканини виявлено надзвичайно високий рівень фосфодіестерази цГМФ.
Для фосфодіестерази характерна наявність множинних форм. Ці форми розрізняються як по молекулярній масі, так і спорідненості до одного і того ж і до різних циклічних нуклеотидів. Загалом, спорідненість до циклічних нуклеотидів у фосфодіестераз у 100–1000 разів нижча, ніж у протеїнкіназ А та G, тому при прискоренні синтезу нуклеотидів спочатку відбувається насичення циклічними нуклеотидами регуляторних центрів кіназ і лише потім – гідроліз цАМФ та цГМФ фос.
У мозку містяться Са-кальмодулінрегульовані форми як цАМФ-синтезуючого, так і цАМФ-гідролізуючого ферментів. Са-кальмодулінзалежна фосфодіестераза є гомодимером, що складається з субодиниць з різною молекулярною масою у різних ізоформ ферменту. Обмежений протеоліз субодиниці 60 кД призводить до появи фрагмента з Мг = 36 кД та незворотної активації фосфодіестерази. Фрагмент 36 кД більше не активується кальмодуліном. Отже, субодиниці фосфодіестерази включають 2 фрагменти: каталітичний та регуляторний.
Аналіз регуляторних властивостей фосфодіестерази в нервовійтканини свідчить про тісне сполучення між цАМФ-і Са-залежними системами внутрішньоклітинної сигналізації; це сполучення може модулюватися за допомогою ізоферментів фосфодіестерази. Так, у мозку бика знайдено 2 ізоформи Са-КМ-залежної фосфодіестерази, що складається з субодиниць з Мг = 60 і 63 кД. Ізофермент із субодиницями 60 кД може бути фосфорильований цАМФ-залежною протеїнкіназою, що призводить до зменшення спорідненості фосфодіестерази до кальмодуліну. Дефосфорилювання цього ізоферменту здійснює Са-КМ-стимульована протеїнфосфатаза; при цьому відновлюється чутливість фосфодіестерази до кальмодуліну.
На відміну від ізоферменту із субодиницями 60 кД фосфорилювання ізоформи фосфодіестерази із субодиницями 63 кД здійснюється Са-КМ-залежними протеїнкіназами. Це фосфорилювання також призводить до втрати чутливості фосфодіестерази до кальмодуліну і "звертається" Са-КМ-стимульованої протеінфосфатазою з відновленням чутливості фосфодіестерази до КМ. Очевидно, такий механізм регуляції фосфодіестерази реалізується в мозку in vivo, незважаючи на дуже високу концентрацію, що "насичає", в ньому КМ. Фосфорування знижує спорідненість ферменту до КМ та обумовлює залежність його активності від фізіологічних концентрацій Са+.
У нервовій тканині, таким чином, існує тісний взаємозв'язок між двома системами вторинних посередників, Са + і цАМФ, що здійснюється за допомогою цАМФ-і Са-залежного фосфорилування-дефосфорилування різних ізоферментів фосфодіестерази цАМФ. Цей взаємозв'язок може модулюватися також різною спорідненістю до Са + аденілатциклази, фосфодіестерази, протеїнкінази та фосфатази. Так, аденілатциклаза мозку активується набагато нижчими концентраціями Са ніж фосфодіестераза.
Крім циклічних нуклеотидів, Са+ таобмеженого протеолізу фосфодіестеразу активують також поліаніони, фосфоліпіди, жирні кислоти. Інгібіторами чи активаторами ферменту є численні фармакологічні речовини. Фосфодіестераза є більш "зручною" мішенню для дії лікарських препаратів, ніж аденілатциклаза, оскільки менш специфічна щодо ефекторних впливів. Потужними інгібіторами фосфодіестерази є похідні ксантинів – інгібування здійснюється блокадою алостеричного центру зв'язування нуклеотидів.
2. цГМФ-залежне протеінфосфорилування
Фермент складається з двох приблизно ідентичних субодиниць, кожна з яких має каталітичну активність і здатна пов'язувати циклічний нуклеотид. Обмеженим протеолізом можна перевести димер мономери і потім розділити кожну субодиницю на цГМФ-зв'язуючий і каталітичний фрагменти. Ці дослідження поряд з виявленою гомологією між протеїнкіназою G і протеїнкіназою А II типу за субстратною специфічністю, амінокислотною послідовністю, здатністю до аутофосфорилювання, імунологічними властивостями привели до уявлення про те, що цАМФ і цГМФ-залежні протеїнкінази еволю. У процесі розвитку цАМФ-залежний фермент став синтезуватися у вигляді роз'єднаних компонентів, тоді як цГМФ-залежна протеїнкіназа синтезується як один ланцюг.
На відміну від каталітичної субодиниці протеїнкінази А, здатної вивільнятися під час активації ферменту, внутрішньоклітинне переміщення "недисоційованої" протеїнкінази G може бути ускладненим. На підставі амінокислотного аналізу протеїнкінази G було встановлено, що одна субодиниця ферменту містить два центри зв'язування нуклеотиду.
Регуляторна N-кінцева половина молекулипротеїнкінази G подібна до сімейства цАМФ-зв'язувальних білків, у той час як каталітична Кінцева половина споріднена з групою кіназ з різною специфічністю. Протеїнкіназа G здатна до аутофосфорилювання з розрахунку 2 моля фосфату на 1 моль холоферменту. Аутофосфорилювання не змінює спорідненості до цГМФ і трохи підвищує Vmakc фосфотрансферазної реакції, але помітно збільшує спорідненість протеїнкінази G до цАМФ. Таким чином, аутофосфорилювання може зумовлювати регуляцію протеїнкінази G не тільки за допомогою цГМФ, але й цАМФ.
Протеїнкіназа G фосфорилює, ймовірно, ті ж амінокислотні залишки в молекулі субстрату, що і протеїнкіназа А, але з набагато меншою швидкістю. Різна швидкість фосфорилювання протеїнкіназ А та G може бути основою їх субстратної специфічності.
Збільшення рівня цГМФ обумовлено взаємодією з плазмалемою різних гормонів та нейромедіаторів. Так активується пов'язана з мускариновими рецепторами гуанілатциклаза. Активація гуанілатциклази зазвичай обумовлена мобілізацією Са+ з ендоплазматичного ретикулуму.
У клітинах мозку виявлено термостабільний білок, що стимулює активність протеїнкінази G, але не змінює активність протеїнкінази А. Зворотний процес – інактивація протеїнкінази G полягає у гідролізі цГМФ фосфодіестеразою, специфічною для цього нуклеотиду. Крім того, в тканинах ссавців, у тому числі нервової, знайдено інгібітор G-кінази з Мг = 15 кД.
Зазначимо, що системи циклічних нуклеотидів здійснюють внутрішньоклітинну регуляцію у тісній взаємодії одна з одною. Так, наприклад, якщо концентрація цАМФ у клітині тривалий час підвищена, може відбуватися фосфорилювання білків, вбудованих у канали плазматичної мембрани, що призводить до підвищення в цитоплазмі концентрації Са+. В результаті цього активуються фосфодіестераза та гуанілатциклаза; відповідно прискорюється гідроліз цАМФ та утворюється цГМФ.
Отже, цГМФ відіграє важливу роль у нервовій системі, особливо в клітинах Пуркіньє мозочка. Про це свідчить вибіркова локалізація у цих клітинах усіх компонентів системи цГМФ, включаючи гуанілатциклазу, протеїнкіназу G та G-субстрат. Різні нейромедіатори, у тому числі ацетилхолін, викликають збільшення рівня цГМФ у клітинах Пуркіньє та активацію G-кінази, що, очевидно, модулює такі властивості цих клітин, як швидкість проведення збудження та здатність до стимуляції.
Встановлено також, що цГМФ модулює активність іонних каналів мембран нервових клітин. Так, введення в нейрони равлика цГМФ або G-кінази збільшує провідність Са-каналів.