Якісні реакції на амінокислоти, пептиди, білки
Амінокислоти можна виявити за допомогою кольорових реакцій: нінгідринової, ксантопротеїнової, Фоля, Мілона, біуретової проби та ін Ці реакції неспецифічні, т.к. засновані на виявленні окремих фрагментів у структурі амінокислот, які можуть траплятися і в інших сполуках.
Нінгідринова реакція, кольорова реакція, що застосовується для якісного та кількісного визначення амінокислот, амінокислот та амінів. При нагріванні в лужному середовищі нінгідрину (трикетогідринденгідрату, С9НбО4) з речовинами, що мають первинні аміногрупи (-NH2), утворюється продукт, який має стійке інтенсивне синьо-фіолетове забарвлення з максимальним поглинанням близько 570нм. Оскільки поглинання при цій довжині хвилі лінійно залежить від числа вільних аміногруп, нінгідринова реакція послужила основою для їх кількісного визначення методами колориметрії або спектрофотометрії. Ця реакція використовується також для визначення вторинних аміногруп (>NH) в імінокислотах - проліні та оксипроліну; у цьому випадку утворюється продукт яскраво-жовтого кольору. Чутливість – до 0,01%. Сучасний автоматичний амінокислотний аналіз проводять, поєднуючи іонообмінний поділ амінокислот та кількісне визначення їх за допомогою нінгідринової реакції. При поділі сумішей амінокислот методом паперової хроматографії дозволяє визначати кожну амінокислоту в кількості не менше 2-5 мкг.
За інтенсивністю фарбування можна будувати висновки про кількості амінокислот.
Ця реакція позитивна як із вільними амінокислотами, а й пептидами, білками та інших.
Ксантопротеїнова реакціядозволяє виявити ароматичні амінокислоти (фенілаланін, тирозин, гістидин, триптофан), заснована на реакції електрофільного заміщення в ароматичному ядрі(Нітрування).
При дії концентрованої азотної кислоти, наприклад, тирозин утворюється продукт, пофарбований у жовтий колір.
Реакція Фоля.Це реакція на цистеїн та цистин. При лужному гідролізі «слабозв'язана сірка» в цистеїні та цистині досить легко відщеплюється, у результаті утворюється сірководень, який, реагуючи з лугом, дає сульфіди натрію або калію. При додаванні ацетату свинцю (II) утворюється осад сульфіду свинцю (II) сіро-чорного кольору.
Опис досвіду. У пробірку наливають 1 мл розчину цистину, додають 0,5 мл 20% розчину гідроксиду натрію. Суміш нагрівають до кипіння, потім додають 0,5 мл розчину ацетату свинцю(II). Спостерігається випадання сіро-чорного осаду сульфіду свинцю (II):
Реакція Циммермана.Це реакція на амінокислоту гліцин.
Опис досвіду. До 2 мл 0,1%-го розчину гліцину, доведеного додаванням 10%-го розчину лугу до рН = 8, доливають 0,5 мл водного розчину о-фталевого діальдегіду. Реакційна суміш починає повільно фарбуватись у яскраво-зелений колір. За кілька хвилин випадає зелений осад.
Реакція на триптофан.Триптофан, реагуючи в кислому середовищі з альдегідами, утворює забарвлені продукти конденсації. Наприклад, з гліоксиловою кислотою (що є домішкою до концентрованої оцтової кислоти) реакція протікає за рівнянням:
За аналогічною схемою протікає і реакція триптофану з формальдегідом.
Реакція Сакагучі.Ця реакція на амінокислоту аргінін заснована на взаємодії аргініну з α-нафтолом у присутності окислювача. Її механізм ще повністю не з'ясований. Очевидно, реакція здійснюється за наступним рівнянням:
Оскільки похідні хінонімінів (в даному випадкунафтохінону), у яких водень іміногрупи -NH-заміщений на алкільний або арильний радикал, завжди пофарбовані в жовто-червоні тони, то, мабуть, оранжево-червоний колір розчину при проведенні реакції Сакагучі пояснюється виникненням похідного нафтохіноніміну. Не виключена, однак, ймовірність утворення ще більш складного з'єднання за рахунок подальшого окислення NH-груп аргінінового залишку і бензольного ядра α-нафтола, що залишилися:
Опис досвіду. У пробірку наливають 2 мл 0,01% розчину аргініну, потім додають 2 мл 10% розчину їдкого натру і кілька крапель 0,2% спиртового розчину -нафтола. Вміст пробірки добре перемішують, доливають 0,5 мл розчину гіпоброміту та знову перемішують. Негайно додають 1 мл 40%-го розчину сечовини для стабілізації оранжево-червоного фарбування, що швидко розвивається.
Біуретова реакція– використовується як кольорова реакція на білки. У лужному середовищі у присутності солей міді(II) вони дають фіолетове забарвлення. Забарвлення обумовлене утворенням комплексної сполуки міді(II), за рахунок пептидної групи-СО-NH-, яка характерна для білків. Свою назву ця реакція одержала від похідного сечовини - біурету, який утворюється при нагріванні сечовини з відщепленням аміаку:
Крім білків і біурету таке ж фарбування дають і інші сполуки, що містять цю групу: аміди, іміди карбонових кислот, а також сполуки, що містять в молекулі групи -CS-NH- або =CH-NH-. Також реакцію дають білки, деякі амінокислоти, пептиди, біурет та середні пептони.
Колір комплексу, що отримується при біуретової реакції з різними пептидами, дещо відрізняється і залежить від довжини пептидного ланцюга. Пептиди з довжиною ланцюга від чотирьох амінокислотних залишків та вище утворюютьчервоний комплекс, трипептиди – фіолетовий, а дипептиди – синій.
кетонна форма поліпептиду
єнольна форма поліпептиду
При взаємодії поліпептиду з Cu(OH)2 утворюється комплекс, будову якого можна показати так: