КАЛЬЦІЙ-ІНДУКОВАНИЙ ВИКИД ДЕПОНУВАНОГО КАЛЬЦІЮ ВИЗНАЧУЄ ТРИГІРНИЙ ХАРАКТЕР ВІДПОВІДЬ

визначує

Ціна:

Автори роботи:

Науковий журнал:

Рік виходу:

Текст наукової статті на тему «КАЛЬЦІЙ-ІНДУКОВАНИЙ ВИКИД ДЕПОНОВАНОГО КАЛЬЦІЮ ВИЗНАЧУЄ ТРИГІРНИЙ ХАРАКТЕР ВІДПОВІДЕЙ МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ СТРОМАЛЬНИХ КЛІТИН НА НОРАДРЕНАЛІН»

КАЛЬЦІЙ-ІНДУКОВАНИЙ ВИКИД ДЕПОНУВАНОГО КАЛЬЦІЮ ВИЗНАЧУЄ ТРИГІРНИЙ ХАРАКТЕР ВІДПОВІДЕЙ МЕЗЕНХІМАЛЬНИХ СТРОМАЛЬНИХ КЛІТИН НА НОРАДРЕНАЛІН

За допомогою флуоресцентної мікроскопії та Са2+-індикатора Б1іо-4 аналізували здатність різних агоністів гептаспіральних рецепторів (0-рго1ет-соир1еф стимулювати Са2+-сигналізацію в мезенхімальних стромальних клітинах (МСК) жирової тканини людини в культурі. Зокрема, була ідентифікована

5% субпопуляція клітин, що специфічно відповідають на но-радреналін мобілізацією внутрішньоклітинного Са2+. Характерною особливістю цих клітин виявилося те, що відповіді на норадреналін генерувалися за принципом "все або нічого": агоніст або не стимулював детектовану мобілізацію цитозольного Са2+ при концентрації менше порогової (100-200 нМ), або викликав Са2+-відповіді практично максимальної амплітуди. Використовуючи фотоліз фоточутливого Са2+-хелатора МР-БОТЛ, створювалися локальні та глобальні зміни вільного Са2+ у цитоплазмі МСК. Тотальне стрибкоподібне підвищення концентрації Са2+ вище за пороговий викликало норадреналін-подібні відповіді клітин. При локальному вивільненні Са2+ швидкість поширення Са2+-сигналу в цитоплазмі МСК на два порядки перевищувала швидкість пасивного поширення за рахунок дифузії у присутності Са2+-буфера. Ці факти свідчили про те, що в МСК функціонує механізм, що забезпечує Са2+-індуковане вивільнення депонованого Са2+. Інгібіторний аналіз показав, що з двохможливих мішеней внутрішньоклітинного Са2+, що забезпечують запуск регенеративного процесу, - ріанодинового рецептора і 1Р3-рецептора - саме останній виконує роль тригера. Отримані дані дозволяють припустити, що тригерний характер відповідей МСК на норадреналін визначається тим, що після досягнення порогового рівня початковий агоніст-залежний підйом внутрішньоклітинного Са2+ стимулює 1Р3-рецептори і запускає лавиноподібний викид Са2+ з депо.

Ключові слова: мезенхімальні стромальні клітини, адренорецептори, Са2+-сигналізація, ріанодинові та 1Р3-рецептори.

Більшість робіт з мезенхімальними стовбуровими клітинами присвячені аналізу їхнього трансплантаційного потенціалу, дослідженню їх диференціювання та можливості керувати цим процесом in vitro [1, 2]. Фундаментальним дослідженням фізіологічних процесів у цих клітинах приділяється набагато менша увага, внаслідок чого існуючі уявлення про їх рецепторні та сигнальні системи дуже обмежені. Хоча внутрішньоклітинні іони кальцію є універсальним регулятором процесів проліферації та диференціювання та одним з основних медіаторів, залучених у внутрішньоклітинну сигналізацію, дослідження в

цій галузі представлені одиничними роботами. Переважно вони стосуються вивчення спонтанних кальцієвих осциляцій та участі зовнішнього кальцію у розвитку мезенхімальних стовбурових клітин [3]. Тим більше що, більш актуальним є вивчення індукованої Са2+-сигналізації, тобто. сигналізації, що стимулюється зовнішнім впливом, у тому числі агоністами різних рецепторів. Серед них можуть виявитися агенти, що запускають диференціювання цих клітин, що представляє безперечний практичний інтерес.

Дуже складним, якщо взагалі розв'язним, є завдання фізіологічнихдосліджень

індивідуальних мезенхімальних стовбурових клітин in situ. Тому зазвичай аналізуються стовбурові клітини, виділені за певною методикою з різних тканин і підтримуються в первинній культурі, для яких використовується спеціальний термін - мезенхімальні стромальні клітини (МСК) [4]. Одним із поточних завдань наших досліджень є аналіз фізіологічних процесів у МСК, отриманих із жирової тканини людини. Оцінюючи їх здатність відповідати на різні агоністи гептаспіральних (G-protein-coupled) рецепторів, ми, зокрема, встановили, що норадреналін стимулює Са2+-сигналізацію в цих клітинах. У цьому роботі демонструємо тригерний характер Са2+-ответов МСК на норадреналін і показуємо, що це характерне властивість детермінується механізмом Са2+-индуцированного вивільнення депонованого Са2+.

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ

Виділення МСК із жирової тканини та їх культивування. МСК людини виділяли із підшкірної жирової клітковини здорових донорів (вік від 31 до 50 років, n = 18). Жирову тканину подрібнювали та змішували з розчинами ферментів колагенази I типу (200 од/мл) (Worthington, США) та диспази (40 од/мл) (Sigma, США) у співвідношенні об'єму тканини до обсягу ферментативного розчину 1 : 2. Суспензію інкубували 37°С протягом 30-60 хв, періодично струшували. Потім до отриманої суспензії додавали рівний обсяг середовища Basal Medium for Undifferentiated Human Mesenchymal Stem Cell (HyClone, США), що містить 10% Advance Stem Supplement (HyClone) для інактивації ферментів, центрифугували при 200g 10 хв. Супернатант та фракцію адипоцитів видаляли. Осад ресус-пендували та лізували еритроцити. Отриману суспензію фільтрували через нейлонові фільтри з розміром пір 100 мкм (BD Bioscience, США). Клітини ресуспендували всередовищі зростання (див. нижче), висаджували в чашки Петрі в кількості 100 тис. клітин/мл і інкубували при 37°З 5% СО2. Наступного дня у чашках міняли середовище для видалення неприкріплених клітин.

Виділені МСК культивували на пластикових чашках Петрі (Corning, США) та/або в 12-лунковому планшеті в середовищі Advance Stem (HyClone) з 10% Advance Stem Supplement (HyClone), 100 од/мл пеніциліну та 100 од/мл стрепт. При досягненні 80% моношару клітини пасирували. Клітини обробляли розчином Версена (Sigma) і HyQTase Cell Detachment Solution (HyClone), а потім розсаджували в соотно-

шении 1 : 4. В експериментах використовували МСК 2-4 пасажів.

Підготовка клітин до експерименту. Перед експериментом клітини культивувалися в середовищі (див. вище) без антибіотика протягом 12 год. Потім клітини промивалися двічі розчином Версена (Sigma). Для відокремлення від субстрату клітини інкубувалися 3-5 хв в 2CC мкл ферменту HyQTase (HyClone). Фермент пригнічувався додаванням BCC мкл повного ростового середовища, клітини ресуспендувалися і поміщалися в епен-дорф. Клітини осідали центрифугуванням при 0.8g протягом 45 с.

Єлетки прикріплювалися за допомогою Cell Tak на дно фотометричної камери, що є покривним склом Menzel-Glaser з пластиковими бортиками, і потім завантажувалися флуоресцентним Cа2+-зондом Fluo-4. Для цього клітини інкубувалися при кімнатній температурі (23-25°C) у присутності проникаючого аналога Fluo-4AM (4 мкМ) у присутності детергенту Plu-ronic (0.02%) (обидва Molecular Probes, США) 20 хв, протягом яких гідроліз внутрішньоклітинними естеразами ацетоксиметилової групи Fluo-4AM продукував достатню кількість Fluo-4. Потім клітини відмивали позаклітинним розчином (NaCl - 110 мМ, KCl - 5.5 мМ, CaCl2 - 2 мМ, MgSO4 - 0.8 мМ, NaH2PO4 - 1мМ, HEPES -10 мМ, глюкоза - 10 мМ), у якому вони витримувалися при 4°C протягом 40 хв. Коли вимагалося, 2 мМ CaCl2 у позаклітинному розчині замінювався на 0.5 мМ EGTA + 0.4 мМ CaCl2, при яких концентрація вільного Са2+ становила 260 нМ.

Мікрофотометрія. Більшість описаних експериментів проводилося з використанням інвертованого флуоресцентного мікроскопа Axiovert 135 (Zeiss, Німеччина), обладнаного об'єктивом Plan NeoFluar 20x/0.75 та цифровою камерою ECCD LucaR (Andor Technology, США). Крім освітлювача світла мікроскоп був обладнаний оптоволоконним освітлювачем для освітлення через об'єктив. Один із входів біфуркаційного оптичного волокна з'єднувався з освітлювачем на надяскравих діодах (340-535 нм) [5] для збудження флуоресценції, а інший - з лазером LCS-DTL-374QT (Лазер-Експорт, Україна), який використовувався для стимуляції фотолізу хвилі 355 нм. Флуоресценція клітин, навантажених Fluo-4, порушувалась на довжині хвилі 480 ± 5 нм, а емісія реєструвалася в області 535 ± 20 нм. На секунду реєструвалися послідовні флуоресцентні зображення. Зміна концентрації цитозольного кальцію в індивідуальних клітинах оцінювалася щодо відносної зміни інтенсивності флуоресценції цілою

клітини (AF/F0). Кількісний фотометричний аналіз зображень здійснювався за допомогою програми Imaging Workbench 6 (INDEC, США).

Для стрибкоподібної зміни внутрішньоклітинного Са2+ використовувався фоточутливий Са2+-хелатор NP-EGTA. Фотоліз цієї речовини спалахом світла ультрафіолетового діапазону (355 нм) ініціював імпульсне вивільнення Са2+ у цитоплазмі клітини. У відповідних експериментах клітини одночасно навантажувалися Fluo-4 та NP-EGTA.

Конфокальна мікроскопія. У низці експериментіваналізувалося поширення Са2+-сигналу в клітинах з використанням конфокального скануючого мікроскопа Leica TCS SP5 (Leica Microsystems, Germany) та об'єктиву з олійною імерсією Leica HCX PL APO CS 63.0 x 1.40. Клітини за добу до експерименту висаджували на 8-лункові планшети, дно яких утворене покривним склом (Nunc Lab-Tek 8 well chambered coverglass, Thermo Scientific, США). Перед експериментом інкубаційне середовище замінювалося на розчин, що складається з 9 частин середовища МЕМ (HyClone, США), що містить 20 мМ HEPES (HyClone, США), та однієї частини реагенту Pluronic (Abcam Fluo-8 No Wash Calcium Assay Kit, Abcam, Англія) , в якому були розчинені Fluo-8 AM (Abcam Fluo-8 No Wash Calcium Assay Kit, Abcam, Англія) та NP-EGTA AM (Invitrogen, США). У кожну лунку додавали Fluo-8 AM (3 мкМ) і NP-EGTA AM (3 м^), клітини інкубувалися 1 год при 37°С. Потім клітини відмивали серед MEM, що містить HEPES (20 мМ). Зйомку пр

Для подальшого читання статті необхідно придбати повний текст. Статті надсилаються у форматіPDFна вказану при оплаті пошту. Термін доставки становитьменше 10 хвилин. Вартість однієї статті -150 рублів.

Подібні наукові роботи на тему «Біологія»

КОЛІСНИКОВ С.С., КОТОВА П.Д., РОГАЧІВСЬКА О.О., СИСОЄВА В.Ю., ТКАЧУК В.А., ФАДЄЄВА Ю.І. - 2015 р.

КОЛІСНИКОВ С.С., РОГАЧІВСЬКА О.О., СИСОЄВА В.Ю., ТАРАСОВ М.В. - 2015 р.

КОЛІСНИКОВ С.С., КОТОВА П.Д., РОГАЧІВСЬКА О.О., СИСОЄВА В.Ю., ТАРАСОВ М.В. - 2014 р.

БЕРЕЖНОВ А.В., ДОЛГАЧОВА Л.П., ДИННИК В.В., ЗІНЧЕНКО В.П., КАЙМАЧНИКОВ Н.П., МАЇВСЬКИЙ Є.І., ТОЛМАЧОВА А.В., ТУРІВСЬКА М.В., ТУРІВСЬКИЙ Є .А. - 2011 р.