Метод розеткоутворення для визначення Т- та В-лімфоцитів у периферичній крові
ДОСЛІДЖЕННЯ ФАКТОРІВ КЛІТИННОГО ІМУНІТЕТУ
Метод розеткоутворення для визначення
Т- і В-лімфоцитів у периферичній крові.
Основні напрями та методичні засади. Вчення про клітинну кооперацію у здійсненні імунологічної адаптації, імунологічного нагляду за генетичною сталістю внутрішнього середовища організму набуло значного розвитку за два десятиліття свого існування. Виділення тимусзалежної (Т) та тимуснезалежної (В) клітинних систем наприкінці 60-х років дозволило вивчити їх функції та взаємодію та деталізувати ефекторну ланку в реалізації імунної відповіді, визначивши субпопуляції Т лімфоцитів: супресори, хелпери, кілери, клітини антитело друга специфічними рецепторами, за якими вони можуть бути детерміновані в загальному пулі лімфоцитів. Були виявлені специфічні відмінності клітин по мембранним імуноглобулінам, рецепторам до Fc фрагменту імуноглобуліну G, до С3 компоненту комплементу.
Значно ширші сучасні оцінки фагоцитозу в комплексному аналізі генетично детермінованих дефектів імунітету: розпізнавання антигенів макрофагами та подання їх Т лімфоцитів.
Істотне значення в розумінні ролі клітинних реакцій у формуванні клінічних синдромів набуває все вивчення сироваткових факторів: лімфокінів, монокінів, кістково-мозкового стимулятора антитілопродуцентів та ін.
Метод розеткоутворення для визначення Т та В лімфоцитів у периферичній крові.
принцип. Поверхневі рецептори, специфічні для різних субпопуляцій лімфоцитів, виявляються, пов'язуючи еритроцити, нативні або навантажені антитілами до цихрецепторів. Еритроцити утворюють із поверхнею лімфоциту фігуру розетки. За розетку приймають лімфоцит, який приєднав 3-5 еритроцитів. У ряді випадків еритроцити щільно огортають лімфоцит, утворюючи так звану морулу. Інтерпретація цього феномена вкрай суперечлива. Нерідко він відбиває методичні неточності постановки. Феномен розеткоутворення може бути посилений шляхом обробки еритроцитів нейрамінідазою.
Визначення Т-лімфоцитів методом
спонтанного розеткоутворення з еритроцитами барана
Тимузалежні Т лімфоцити мають рецептори для еритроцитів барана, які виступають, таким чином, специфічним маркером для їх розпізнавання (Е-РОК: Erythrocyte -розеткоутворюючі клітини).
Прилади та обладнання.
1. Центрифуг ЦЛК 1.
2. Холодильник (побутовий).
4. Мікроскоп люмінесцентний (МЛ 2 чи інші типи).
5. Камера Горяєва.
6. Лічильник клітин.
7. Автоматичні піпетки або мікропіпетки.
8. Пробірки силіконовані чи пластикові.
9. Штатив для пробірок.
1. Середа 199, розчин Хенкса.
2. Гепарин (готують розчин із розрахунку 25 ОД/мл крові).
3. Фосфатний буфер рН 7,4.
4. 0,01% розчин акридинового помаранчевого.
5. 0,1% розчин еозину, 0,1% розчин трипанового синього на дистильованій воді.
6. Гіпак (ізопак, верографін, уротраст).
7. Фікол 400 (полісахарид з молекулярною масою 400000).
8. Еритроцити барана.
10 мл крові з ліктьової вени вносять у пластикову пробірку з розчином гепарину (256 ОД/мл) та обережно перемішують. Гепаринізовану кров раз водять фосфатним буфером рН 7,4 у співвідношенні 1: 2; 9 мл суміші обережно нашаровують на розчин фіколл-гіпак щільності 1,077 г/мл (12 частин 9 %фіколла та 5 частин 33,9% гіпаку щільності 1,077 г/мл). Пробірки центрифугують 40 хв при 1500 об/хв.
У зв'язку з тим, що можуть використовуватися різні системи центрифуг, необхідно застосовувати режими центрифугування, щоб сила поділу в інтерфазі склала 400 g. Вели чину відцентрового прискорення G обчислюють за формулою: G=l,l*n2 R* 10-5 (n-число обертів за хвилину, R-радіус від центру осі центрифуги до межі дотику суміші фіколл гіпака з суспензією, що розділяється в см).
Після центрифугування шар лімфоцитів обережно випікають піпеткою з інтерфази і двічі відмивають буферним розчином. Концентрацію клітин доводять до 2-4 млн. в 1 мл у середовищі 199, що містить 10% розчин телячої сироватки або сироватки IV (АВ) групи крові людини. При використанні останньої необхідна інактивація при 56 С протягом 30 хв і абсорбція еритроцитами. Для цього 0,5 мл осаду відмитих еритроцитів додають до 1 мл сироватки та інкубують протягом 1 години при 37 °С, періодично струшуючи. Бажана абсорбція сироватки пулом лейкоцитів з огляду на можливість наявності антилейкоцитарних антитіл. При використанні людської сироватки необхідно враховувати вплив аутоцитолімфотоксинів, що виявляють максимум активності при 4 °С.
1 Можна використовувати будь-який буферний розчин рН 7,0-7,2 без іонів Са++ (наявність іонів Са++ сприяє конгломерації клітин, їх коагуляції).
Перед використанням суспензії лімфоцитів перевіряють їхню життєздатність. Рівні об'єми 0,1% розчину водного еозину на середовищі Хенкса або Рінгера подвійної концентрації без глюкози та 0,1% розчину трипанового синього на дистильованій воді змішують перед вживанням і 1-2 краплі додають до краплесуспензії клітин і частину суміші переносять у камеру Горяєва. Пофарбовані (мертві) клітинипрораховують на 100 клітин у полі зору. При правильній обробці відсоток мертвих клітин не перевищує 3.
Приготування еритроцитів барана.
Використовують еритроцити однієї тварини або суміш, отриману від кількох. Еритроцити можна зберігати протягом 2 тижнів при 4 °С у розчині Олсвера (глюкоза -2,05 г, цитрат натрію - 0,8 г, хлорид натрію - 0,42 г, дистильована вода-100 мл), рН цього розчину встановлюють рівним 6,1 за допомогою 10% розчину лимонної кислоти. Перед вживанням еритроцити барана 3-4 рази відмивають фосфатним буфером і готують 0,5% (за обсягом) завис клітин.
Підготовка та облік реакції розеткоутворення. Реакцію проводять за методом, описаним Jondal та співавт. 1972 р.
Для прорахунку клітин у камері Горяєва осад клітин у вилучених з холодильника про бірках обережно ресуспендують пастерівською піпеткою (кілька разів повільно набирають і випускають клітинну суспензію) і додають 0,02 мл 0,01% розчину у буфері фосфатного акридинового оран. Цей фарбник дає яскраво зелену люмінесценцію при збудженні ультрафіолетом. Через 2-3 хв заповнюють камеру Горяєва та визначають відсоток Е РОК шляхом підрахунку 300 лімфоцитів у люмінесцентному мікроскопі. Це значно полегшує і прискорює процедуру рахунку лімфоцитів, що яскраво світяться, оточених рожевими еритроцитами.
У день взяття крові на Т лімфоцити необхідно проводити загальний аналіз крові, який дає можливість обчислювати абсолютні значення Т клітин.
Нормальні величини Т клітин, визначені нами у 150 здорових донорів: 54,3±0,98%; 979,8±16,8 кл/мкл.
Визначення активних Т-лімфоцитів,
утворюють розетки з еритроцитами барана
Усі підготовчі операції виконують так, як це описано для Е-РОК,винятком сироватки, яку щодо ЕА-РОК не додають в інкубаційне середовище, і тривалої холодової інкубації. Після термостатування 10 хв при 37 °З наступного центрифугування при 1000 об/хв (для ЦЛК 1) протягом 5 хв проводили підрахунок Т активних лімфоцитів способом, описаним вище для загальних Т клітин.
Вміст Т активних лімфоцитів у 150 здорових донорів становив: 34,6±1,92%, 840+123 кл/мл.
Визначення теофілінчутливості Т клітин.
Препарати, що підвищують рівень внутрішньоклітинного цАМФ (теофілін, аденозин), пригнічують реакцію спонтанного розеткоутворення між зрілими Т лімфоцитами та еритроцитами барана.
Реактиви та обладнання, що використовуються, аналогічні для описаного вище методу визначення Т активних лімфоцитів. Виняток становить теофілін (хімічно чисте з'єднання), 0,3 М розчин якого на дистильованій воді, підігрітій до 60 ° С, готують щоразу при постановці методу. Охолоджений до кімнатної температури теофілін додають в інкубаційне середовище (без додавання сироватки), термостатують, центрифугують і прораховують клітини так само, як активні Т. Виявляють 2 субпопуляції: теофілінчутливі клітини Т, тобто. лімфоцити, що втратили здатність до розеткоутворення під впливом обробки теофіліном, і теофіліностійкі Т клітини. У здорових донорів співвідношення теофілін чутливих та стійких Т клітин становить 1:3.
Виявлення Т лімфоцитів, що утворюють розетки з алогенними та аутологічними еритроцитами.
Існують субпопуляції лімфоцитів, що утворюють розетки з алогенними та аутологічними еритроцитами.
Прилади, обладнання та реактиви описані вище. Суспензію лімфоцитів виділяють описаним вище методом.
Еритроцити людини: необхідновикористовувати еритроцити 0(1) резус-негативної групи крові. Слід брати по можливості кров декількох постійних донорів. Приготування еритроцитів аналогічно до описаного методу для еритроцитів барана. До суспензії лімфоцитів у тих же співвідношеннях додають одночасно еритроцити барана та еритроцити людини. Прораховують лімфоцити, що зв'язали еритроцити і барана, і людини. Реакцію з аутологічними еритроцитами проводять так само, як з алогенними.
Визначення В-клітин методом розеткоутворення
з еритроцитами барана у системі ЕАС.
Тимуснезалежні лімфоцити мають на своїй мембрані специфічні детермінанти, що дозволяють диференціювати їх від Т лімфоцитів. Таким детермінантом є поверхневий (мембранний) імуноглобулін класу М. Число лімфоцитів, що несуть імуно глобулін A, G, Е або D, вкрай незначно (А-1-5%, D і Е-2-4%), рецептори для Fc фрагмента імуноглобуліну G для третього компонента комплементу (ЗЗ). Виділяють інші специфічні рецептори, зокрема для вірусу Епштейна-Барр, плазмоклітинний антиген, антиген 1а. Однак останні не знайшли ще відображення у клінічній практиці. Найчастіше застосовується метод виявлення клітин за їх здатністю утворювати розетки з баранячими еритроцитами, навантаженими антитілами в середовищі комплементу. Такі еритроцити маркують і Fc, і Сз рецептори лімфоцитів.
Прилади та реактиви ті ж, що й для методу визначення Т лімфоцитів. Аналогічно готують суспензію лімфоцитів. Антисироватку, що містить антитіла до еритроцитів, готують шляхом імунізації кролика еритроцитами барана або бика. Кролику в крайову вену вуха вводять 3-5 мл 50% суспензії еритроцитів. На 4-6-й день у нього беруть кров і одержують сироватку, яка в цей період на висоті імунної відповіді переважномістить антитіла класу М. Найкращий ефект отримують при роботі з гамма глобулінової фракції сироватки, яку одержують висолення в насиченому розчині аміаку або риванолу. Антисироватку інактивують та визначають її гемолітичний та аглютинаційний титр.
Можна використовувати готову та широко доступну кролячу гемолітичну сироватку.
Комплементи. Джерелом комплементу є свіжі сироватки мишей. Безпородних мишей декапітують, кров зливають у пробірку, отримують сироватку, яку потім сорбують пулом людських еритроцитів та визначають активність комплементу у гемолітичній системі.
Змішують рівні обсяги 1% суспензії баранячих еритроцитів (переважно еритроцити б
ка) та антисироватки до виду еритроцитів, що використовуються в реакції (або кролячої гемолітичної сироватки) у субаглютинуючому розведенні. Суміш інкубують 40 хв при 37 °С, обережно струшуючи кожні 10 хв. Після термостатування еритроцити відмивають тричі фосфатним буфером до 10 хв при 1500 об/хв. Супернатант відкидають, а осад додають початковий обсяг фосфатного буфера і рівний обсяг абсорбованої мишачої сироватки, що містить комплемент у розведенні 1 : 10. Суміш поміщають в термостат при 37 °С на 30 хв. Знову еритроцити тричі відмивають. При відмиванні центрифугують їх обережно при 1000 об/хв 5 хв, щоб не викликати аглютинації еритроцитів. Готують 0,5% суспензію еритроцитів та переглядають під мікроскопом. За наявності аглютинації еритроцитів суспензія непридатна. Готові еритроцити, навантажені антитілами та комплементом (ЕАС), можна зберігати у холодильнику (4 °С) 4-5 днів.
Визначення ЄАС лімфоцитів.
До 0,1 мл суспензії лімфоцитів додають 0,1 мл сенсибілізованих еритроцитів. Оптимальне співвідношення еритроцитів долімфоцитам дорівнює 20: 1. Суміш інкубують 45 хв при 37 ° С, після чого пробірки поміщають у лід. Підрахунок клітин проводять описаним вище способом (див. «Визначення Т клітин»).