Спосіб діагностики опійної наркоманії, що діє, у хворих на хронічний вірусний гепатит з
Власники патенту UA 2417759:
Винахід відноситься до галузі медицини, зокрема до гастроентерології. Для діагностики діючої опійної наркоманії у хворих на хронічний вірусний гепатит С визначають базальний, стимульований рівень та індекс стимуляції фактора некрозу пухлини-α (ФНП-α); базальний та стимульований рівень інтерферону-γ (ІФН-γ); індекс стимуляції інтерлейкіну-2 (ІЛ-2); базальний рівень інтерлейкіну-4 (ІЛ-4). При значенні базального ФНП-α від 12 пг/мл до 50 пг/мл, стимульованого ФНП-α від 15 пг/мл до 80 пг/мл, індексу стимуляції ФНП-α від 0,65 до 1,78, базального ІФН-γ від 20 пг/мл до 22 пг/мл, стимульованого ІФН-γ від 20 пг/мл до 22 пг/мл, індексу стимуляції ІЛ-2 від 1 до 1,45, базального ІЛ-4 від 9,1 пг/мл до 11,8 пг/мл діагностують опійну наркоманію, що діє. Спосіб підвищує точність діагностики опійної наркоманії, що діє, у хворих на хронічний вірусний гепатит С. 1 табл.
Винахід відноситься до галузі медицини, зокрема гастроентерології, і може бути використане для діагностики опійної наркоманії, що діє, у хворих на хронічний вірусний гепатит С.
В даний час до 90% молоді, інфікованої хронічними вірусними гепатитами, хворіють на ін'єкційну наркоманію. Сформовано поняття про наркозалежний епідеміологічний процес при хронічному вірусному гепатиті С [1, 2, 3, 4]. Викликаючі гепатити віруси виявляються у хворих на наркоманію і нерідко в комплексі з токсичним впливом опіатів є причиною хронічних уражень печінки [5, 6]. Переважно це особи молодого віку (15-29 років), які зазвичай мають маркери поєднаної вірусної інфекції HCV+HBV [7, 8, 9]. Наркотичні речовини за даними ряду робіт посилюють біохімічні, мікроциркуляторні, імунологічні таморфологічні порушення при вірусних гепатитах [1, 6, 2, 9].
Враховуючи імуноопосередковані механізми пошкодження печінки при хронічному вірусному гепатиті С, імуносупресивний та токсичний вплив опіатів, молодий вік хворих та важкі результати хронічних вірусних гепатитів, безсумнівно, вкрай актуальною стає проблема об'єктивної діагностики опійної наркоманії, що діє.
В даний час накопичений великий матеріал, що свідчить про грубі зміни імунологічної реактивності у хворих, які страждають на опійну наркоманію. З вживанням опіоїдів пов'язують тяжче ураження печінки за рахунок зменшення в крові CD3+, CD4+, CD8+, зменшенням співвідношення CD4+/CD8+ [10], відзначають імунологічну недостатність з переважним порушенням Т-клітинної ланки імунітету, що супроводжується значним зниженням CD1+фоцитів ].
Підходи до лікування хронічного вірусного гепатиту З призначення противірусної терапії вимагають абстиненції, тривалість якої має становити щонайменше півроку. Для вирішення питання призначення лікування дуже важливо об'єктивно оцінити наявність або відсутність абстиненції, чому і присвячений наш спосіб діагностики.
Нове технічне завдання - створення способу діагностики опійної наркоманії, що діє, у хворих на хронічний вірусний гепатит С.
Для вирішення поставленого завдання у способі діагностики діючої опійної наркоманії у хворих на хронічний вірусний гепатит С визначають базальний, стимульований рівень та індекс стимуляції фактора некрозу пухлини-α (ФНП-α), базальний та стимульований рівень інтерферону-γ (ІФН-γ), індекс стимуляції інтерлейкіну-2 (ІЛ-2) та базальний рівень інтерлейкіну-4 (ІЛ-4) та при значенні базального ФНП-α від 12 пг/мл до 50 пг/мл,стимульованого ФНП-α від 15 пг/мл до 80 пг/мл, індексу стимуляції ФНП-α від 0,65 до 1,78, базального ІФН-γ від 20 пг/мл до 22 пг/мл, стимульованого ІФН-γ від 20 пг/мл до 22 пг/мл, індексу стимуляції ІЛ-2 від 1 до 1,45, базального ІЛ-4 від 9,1 пг/мл до 11,8 пг/мл діагностують опійну наркоманію, що діє.
Спосіб здійснюють наступним чином. При зверненні пацієнта з діагностованим хронічним вірусним гепатитом визначали рівень базального, стимульованого ФНП-α, індекс стимуляції ФНП-α, базального та стимульованого ІНФ-γ, індекс стимуляції ІЛ-2, базальний рівень ІЛ-4.
Визначення рівнів ФНП-α, ІНФ-γ, ІЛ-2, ІЛ-4 у супернатантах культивованих мононуклеарів проводили з використанням твердофазного імуноферментного сендвічового методу. В основі цієї ідентифікації лежить кон'югація одного епітопу молекули цитокіну мишачими моноклональними антитілами, сорбованого на твердій фазі мікропланшета. Процедуру виконання імуноферментного аналізу проводили за інструкціями, запропонованими виробниками тест-систем (Procon, Україна; Cytimmune, США).
Для отримання супернатантів виділені мононуклеари ресуспендували у повному поживному середовищі, що складається з 90% RPMI-1640, 10% інактивованої (при 56°С протягом 30 хв) ембріональної телячої сироватки - (ICN Biomedicals Inc., США/, США) л L-глутаміну, 100 мг/л гентаміцину та 2 мМ/л HEPES («Flow», Великобританія). Стандартизували кількість клітин суспензії до 2,0×10 6 /мл. Для стимуляції секреторної здатності лімфоцитів у проби вносили фітогемагглютінін (ФГА) («Difco», Німеччина) у концентрації 0,01 мг/мл культури. Клітинні суспензії у кількості 2 мл інкубували при 37°С та 5% CO2 протягом 24 год. Після інкубації пробірки струшували, центрифугували 10 хв при 1500об/хв, супернатант збирали та використовували для кількісного визначення концентрації цитокінів [15].
Для дослідження здатності мононуклеарних лейкоцитів продукувати ІНФ-γ в лунки попередньо промитого мікропланшета вносили по 200 мкл "Про дозу" та стандартів ІНФ-γ з відомими концентраціями. У комірки, що залишилися, поміщали по 100 мкл супернатанту і фосфатного буфера, інкубували протягом 1 год при 37°С. Після триразового циклу промивання лунки мікропланшета додавали по 200 мкл других антитіл і також інкубували 1 год при 37°С. Тричі промив планшет буфером, в кожну комірку вносили по 200 мкл кон'югату пероксидази хрону з антивидовими поліклональними антитілами і поміщали в термостат на 1 год. Після триразового циклу промивання в лунки додавали по 200 мкл розчину субстрату. Через 15-20 хв інкубації в затемненому місці при кімнатній температурі вносили 50 мкл стоп-реагенту (0,5 М сірчана кислота).
Для оцінки рівнів ФНП-α, ІЛ-2 та ІЛ-4 мікропіпеткою додавали по 100 мкл «0 дози» та стандартів даних цитокінів з відомими концентраціями у відповідні осередки попередньо промитого буфером мікропланшета. В інші лунки вносили супернатант обсягом 100 мкл і інкубували протягом 1 год при 37°С. Після кількох циклів промивання в кожну комірку додавали по 100 (для визначення ФНП-α та ІЛ-4) та 200 (ІЛ-2) мкл розчину других антитіл і проводили годинну інкубацію при 37°С. Промив планшети буфером і дистильованою водою, в кожну лунку вносили по 100 (ФНП-α та ІЛ-4) і 200 (ІЛ-2) мкл кон'югату стрептавидину з пероксидазою хрону і інкубували 30 хв при 20-25°С ІЛ-4) та 1 год при 37°С (ІЛ-2). Після закінчення інкубації, промивши мікропланшети, до кожного осередку додавали по 100 (ФНП-α і ІЛ-4) і 200 (ІЛ-2) мкл розчину субстрату збарвником. Через 10-15 хв у лунки вносили по 50 мкл стоп-реагенту.
Облік результатів імуноферментного аналізу проводили за допомогою фотометра для мікропланшетів Multiscan EX (ThermoLabSystems, Фінляндія) при довжині хвилі 450 нм. Концентрацію цитокінів обчислювали за калібрувальною кривою.
При значенні базального ФНП-α від 12 пг/мл до 50 пг/мл, стимульованого ФНП-α від 15 пг/мл до 80 пг/мл, індексу стимуляції ФНП-α від 0,65 до 1,78, базального ІФН-γ від 20 пг/мл до 22 пг/мл, стимульованого ІФН-γ від 20 пг/мл до 22 пг/мл, індексу стимуляції ІЛ-2 від 1 до 1,45, базального ІЛ-4 від 9,1 пг/мл до 11,8 пг/мл діагностували опійну наркоманію, що діє.
Пропоновані критерії відібрано на підставі аналізу результатів клінічних спостережень за пацієнтами, які страждають на хронічний вірусний гепатит С і хронічний вірусний гепатит С на тлі опійної наркоманії. Проведено обстеження 49 хворих на хронічний вірусний гепатит С, 16 з яких склали основну групу та були опійними наркоманами з максимальним терміном абстиненції 2 місяці. Усі вони мали позитивну ПЛР до HCV. Вік обстежених становив від 18 до 48 років (середній вік обстежених – 28,2±5,1 років), чоловіків було 40 (81,6%), жінок – 9 (18,4%). Момент включення до дослідження - верифікація у стаціонарі ОКБ м. Томська хронічного вірусного гепатиту С та факт системного регулярного внутрішньовенного вживання опіатів за даними анамнезу. Частина пацієнтів (7 осіб), які вживали наркотики, під час обстеження перебували у стані абстиненції (з максимальним терміном 2 місяці), в інших (9 осіб) дослідження було проведено на фоні прийому опіатів, що підтверджувалося позитивним тестом на наявність опіатів у сечі. У всіх випадках як наркотик використовувався сирець опію. У всіх хворих угрупі опійних наркоманів методом імуноферментного аналізу (ІФА) визначалися маркери перенесеного гострого вірусного гепатиту у вигляді ізольованих НВ cor AT(IgG) та активної HCV інфекції. Тривалість прийому наркотиків становила від 2 до 14 років (середня тривалість опійної наркоманії 6±3,4 років), тривалість інфекції становила від 2 до 14 років (середня тривалість інфекції HCV 7,3±3,6 років). З дослідження були виключені пацієнти, для яких зловживання алкоголем було ізольованим токсичним фактором за наявності хронічного вірусного гепатиту С, пацієнти з противірусним лікуванням в анамнезі з тяжкою супутньою патологією, яка могла б вплинути на тяжкість ураження печінки, виключався факт зловживання лікарськими засобами.
У двох пацієнтів із ізольованим перебігом хронічного вірусного гепатиту С у юності (12 і 10 років тому) мали місце поодинокі епізоди ін'єкційного введення наркотичних речовин, які й спричинили інфікування.
Усім пацієнтам визначали базальний та стимульований рівень ФНП-α, індекс стимуляції ФНП-α, базальний та стимульований рівень ІФН-γ, індекс стимуляції ІЛ-2 та базальний рівень ІЛ-4. Здоровим дорослим добровольцям (15 осіб) оцінювали базальний та стимульований рівень ФНП-α, базальний та стимульований рівень ІФН-γ та базальний рівень ІЛ-4.
Для статистичної обробки фактичного матеріалу використовували статистичний пакет SAS 8.0 (SAS Inc., США). Перевірку на нормальність розподілу фактичних даних проводили за допомогою критерію Шапіро-Вилка. Результати представлені у вигляді медіани, нижнього та верхнього квартилів (Me, Q1-Q3), та середнього ± стандартне відхилення (M±SD).
При проведенні порівнянь незалежних вибірок, прикількості груп = 2 у разі нормального розподілу та рівних дисперсій у групах застосовували t-критерій Стьюдента для незалежних спостережень або критерій Аспера-Уолча при нерівності дисперсій; при відхиленні розподілу від нормального застосовували критерій Манна-Уітні. Статистично значущими вважалися відмінності за p
При аналізі результатів (див. табл.1, в якій представлені дані вмісту імуноцитокінів у супернатантах (пг/мл) у хворих із ізольованим перебігом хронічного вірусного гепатиту С та на тлі опійної наркоманії (Me; Q1:Q3)).
Отримано, що у пацієнтів, які страждають на хронічний вірусний гепатит С, мала місце виражена імуносупресія у порівнянні зі здоровими добровольцями, однак у опійних наркоманів виявлено достовірно нижчі показники імунного статусу як у порівнянні зі здоровими добровольцями, так і в порівнянні з ізольованим перебігом хронічного С. У пацієнтів, які страждають на опійну наркоманію, отримана сукупність вкрай низьких показників цитокінів. Значення базального ФНП-α знаходилися в інтервалі від 12 пг/мл до 50 пг/мл, стимульованого ФНП-α - від 15 пг/мл до 80 пг/мл, індексу стимуляції ФНП-α - від 0,65 до 1,78, базального ІФН-γ - від 20 пг/мл до 22 пг/мл, стимульованого ІФН-γ - від 20 пг/мл до 22 пг/мл,