Спосіб визначення глікогену в екстракті з органів та тканин бджіл, Банк патентів

Спосіб відноситься до галузі ветеринарної медицини, зокрема біохімії. Спосіб полягає в кип'ятінні екстракту, охолодженні, центрифугуванні, розчиненні осаду, охолодженні, центрифугуванні, розчиненні осаду, додаванні в пробірку сірчаної кислоти і 1% розчину конденсату, нагріванні, охолодженні, фотометрировании проти контролю при довжині хвилі 315 нм, а в . Даний спосіб дозволяє підвищити точність визначення та є більш економічним. 1 табл.

Винахід відноситься до галузі ветеринарної медицини, зокрема біохімії тварин

У ветеринарії визначення вмісту глікогену одна із важливих тестів у виявленні енергетичного ресурсу організму бджіл.

Глікоген – полісахарид, або тваринний крохмаль, синтезується організмом і депонується у всіх його органах та тканинах. Глікоген є легко мобілізованою резервною формою глюкози і є розгалуженим полімером із залишків глюкози крові.

Також відоме визначення глікогену в крові [Horeysi J. Et al. Заклади хімічного витребування в лікарстві. Pppraha, 1957. Довідник Біохімічні методи дослідження у клініці. За редакцією академіка АМН СРСР проф. А.А.Покровського. Медицина. М.: - 1969. Визначення глікогену в крові колориметричним методом з орцином (по Хорейші), стор. 230-231], де глікоген осаджують спиртом і гідролізують в кислому середовищі до глюкози і нагрівають у сірчаній кислоті, яка перетворюється на оксиметилфурфурол і конденс , утворюючи забарвлене з'єднання. Все вищезгадане здійснювалося шляхом кип'ятіння досліджуваного біологічного субстрату в концентрованому розчині гідроксиду натрію в центрифужній пробірці, з наступнимдодаванням спирту, охолодженням, центрифугуванням, відбором надосадової рідини, розчиненням осаду в напівнасиченому розчині сірчанокислого натрію з подальшим додатковим охолодженням, центрифугуванням і розчиненням осаду, одночасне додавання в центрифужну пробірку з досліджуваним біологічним субстратом. 13 мл сірчаної кислоти та 1 мл 1% розчину орцину з подальшим нагріванням, охолодженням, фотометрування проти контролю та визначення глікогену за формулою

де Х – кількість глікогену, мг%; Ео – екстинція дослідної проби; Їсть - екстинція стандартного розчину,

Недоліками відомих методів є тривалий трудомісткий процес, недостатньо точне визначення вмісту глікогену в крові, а також відсутність можливості визначення вмісту глікогену в тканинах органів у бджіл.

Технічним рішенням завдання є підвищення точності діагностування, зменшення витрат часу, матеріальних витрат та використання більш доступних хімічних реактивів та розширення технологічних можливостей.

Поставлена ​​задача досягається тим, що в способі визначення вмісту глікогену в екстракті з органів і тканин бджіл, що включає кип'ятіння досліджуваного біологічного субстрату в концентрованому розчині гідроксиду натрію в ценрифужной пробірка з подальшим додаванням спирту, охолодженням, центрифугуванням, відбором сірчанокислого натрію з подальшим додатковим охолодженням, центрифугуванням і розчиненням осаду, одночасне додавання в центрифужну пробірку з досліджуваним біологічним субстратом, контрольну пробірку з водою і пробірку зі стандартним розчином глюкози 13мл сірчаної кислоти та 1 мл 1% розчину конденсату з подальшим нагріванням, охолодженням, фотометрування проти контролю та визначення глікогену за формулою

де Г – кількість глікогену, мг%; Ео – екстинція дослідної проби; Їсть - екстинція стандартного розчину,

як біологічний субстрат використовують екстракт з органів і тканин бджіл, а для кип'ятіння - 30% гідроксид натрію, при цьому охолодження здійснюють протягом 15 хвилин, центрифугують при 3 тис. об/хв протягом 15 хвилин, додають пробірки 2 мл 1% конденсату, як який використовують резерцин, і фотометрируют при довжині хвилі λ=315 нм.

Приклад конкретного здійснення способу визначення вмісту глікогену в екстракті з органів та тканин бджіл

Підготовка екстракту з органів та тканин бджіл.

Для цього у бджіл видаляли зовнішній покрив та кишечник за допомогою пінцету та очних ножиць. Тканини та органи, отримані від десяти бджіл, поміщали у фарфорову ступку і розтирали маточкою, потім до вмісту додали фізіологічний розчин з розрахунку 1:1, наполягали протягом 1-1,5 годин у холодильнику при температурі 5°С і фільтрували через паперовий фільтр .

Для приготування 52% сірчаної кислоти об'ємом 325 мл необхідно взяти 225 мл концентрованої сірчаної кислоти та, обережно приливаючи, 100 мл дистильованої води.

Для приготування 1% розчину резорцину необхідно взяти 1 г резорцину та 99 мл 52% розчину сірчаної кислоти.

Для приготування 30% розчину гідроксиду натрію необхідно взяти 30 г натрію гідроксиду і 70 мл дистильованої води.

Для приготування стандартного розчину глюкози беруть 10 мг глюкози і розчиняють в 300 мл дистильованої води.

Осадження та гідроліз глікогену в екстракті з органів та тканин бджіл.

Відфільтрований екстракт з органів і тканин бджіл поміщали в центрифужну пробірку в кількості 0,3 мл і туди вносили 0,2 мл дистильованої води і 0,2 мл 30% розчину гідроксиду натрію. Потім пробірку поміщали у водяну баню на 1,5-2 години, після охолодження в пробірку вносили 1 мл 96 об.% етилового спирту, суспендували і охолоджували на льоду протягом 15 хвилин, потім центрифугували розчин при 3 тис. об/хв протягом 15 хвилин. Надосадову рідину обережно прибирали пастерівською піпеткою, а осад додавали 1 мл 96 об.% етилового спирту і охолоджували на льоду протягом 15 хвилин, потім знову центрифугували при 3 тис. об/хв протягом 15 хвилин. Після центрифугування надосадову рідину обережно прибирали пастерівською піпеткою, а осад перемішали з 3 мл дистильованою водою, 13 мл 52% розчину сірчаної кислоти (перемішували) та 2 мл 1% резорцину.

У контрольну (чисту пробірку) пробірку та зі стандартним розчином глюкози наливали по 3 мл дистильованої води, по 13 мл 52% розчину сірчаної кислоти (перемішували) та по 2 мл 1% резорцину.

Усі пробірки поміщали у водяну баню при температурі 80°С протягом 20 хвилин, потім охолоджували на льоду протягом 15 хвилин. Пробірки з наявністю глюкози мали коричнево-жовте фарбування.

Фотоколориметрування проводили проти контролю на КФК-3 при доборі довжини хвилі = 315 нм.

Розрахунок вмісту глікогену в екстракті з м'язів проводять за формулою

де Г – кількість глікогену, мг%; Ео – екстинція дослідної проби; Їсть – екстинція стандартного розчину.

Приклад: у бджіл сірої кавказької гірської породи

Е о - екстинція дослідної проби становила 0,566

Е ст - екстинція стандартного розчину склала 0,253

Таким чином, підставляючи у формулу, отримаємо наступний результат:

Таблиця Вміст глікогену в екстракті з органів та тканин бджіл
Породи бджіл	Кількість глікогену, мг %
Італо-карпатська суміш першого покоління	111,5
Карпатська порода	225,0
Пріокська	375,0
Сіра кавказька гірська	224,0

З даних, наведених у таблиці, можна дійти невтішного висновку, що порода бджіл “Приокская” має найбільшим енергетичним ресурсом проти іншими породами бджіл. Ця порода бджіл має стійкість до несприятливих погодних умов і має можливість відтворення потомства з підвищеним імунітетом.

формула винаходу

Спосіб визначення вмісту глікогену в екстракті з органів і тканин бджіл, що включає кип'ятіння досліджуваного субстрату в концентрованому розчині гідроксиду натрію, охолодження, центрифугування, розчинення осаду в розчині сірчанокислого натрію, охолодження, центрифугування, розчинення осаду, одночасне додавання в контрольну пробірку з водою і пробірку зі стандартним розчином глюкози 13 мл сірчаної кислоти і 1% розчину конденсату з подальшим нагріванням, охолодженням, фотометруванням проти контролю та визначення глікогену за формулою: Г=Ео· 100/Е ст мг%, де Г - кількість глікогену в мг%; Ео – екстинція дослідної проби; Ест - екстинція стандартного розчину, при цьому для кип'ятіння субстрату використовують 30%-ний гідроксид натрію, охолоджують - по 15 хв, центрифугують при 3 тис. об./хв по 15 хв, додають у пробірки 2 мл 1% розчину конденсату, як якого використовують резорцин, фотометрують при довжині хвилі 315 нм.

MM4A - Дострокове припинення діїпатенту СРСР або патенту України на винахід через несплату у встановлений термін мита за підтримку патенту в силі

---