Визначення білка з використанням індикатора пирогаллолового червоного

Принцип методу заснований на фотометричному вимірі оптичної щільності розчину забарвленого комплексу, що утворюється при взаємодії молекул білка з молекулами барвника комплексу пирогаллоловый червоний і молібдату натрію (Pyrogallol Red-Molybdate complex) в кислому середовищі. Інтенсивність фарбування розчину пропорційна вмісту білка в досліджуваному матеріалі. Наявність детергентів у реактиві забезпечує рівнозначне визначення білків різної природи та будови.

Реактиви. 1) 1,5 ммоль/л розчин пирогаллолового червоного (ПГК): 60 мг ПГК розчиняють у 100 мл метанолу. Зберігають при температурі 0-5 ° С; 2) 50 ммоль/л сукцинатний буферний розчин pH 2,5: 5,9 г бурштинової кислоти (НООС-СН2-СН2-СООН); 0,14 г оксалату натрію (Na2C2O4) та 0,5 г натрію бензоату (C6H5COONa) розчиняють у 900 мл дистильованої води; 3) 10 ммоль/л розчин кристалогідрату молібдату натрію (Na2MoO4 × 2H2O): 240 мг молібдату натрію розчиняють у 100 мл дистильованої води; 4) Робочий реактив: до 900 мл буферного сукцинатного розчину додають 40 мл розчину ПГК і 4 мл розчину молібдату натрію. pH розчину встановлюють 2,5 за допомогою 0,1 моль/л розчину соляної кислоти (НСl) і об'єм доводять до 1 л. Реактив у такому вигляді готовий до використання та стабільний при зберіганні у захищеному від світла місці та температурі 2–25 °С протягом 6 міс; 5) 0,5 г/л стандартний розчин альбуміну.

Хід визначення. У першу пробірку вносять 0,05 мл досліджуваної сечі, в другу пробірку - 0,05 мл стандартного розчину альбуміну і в третю пробірку (контрольна проба) - 0,05 мл дистильованої води, потім додають пробірки по 3 мл робочого реактиву. Вміст пробірок перемішують і через 10 хвилин фотометрують пробу та стандарт проти контрольної проби при довжині хвилі 596 нм у кюветі з довжиноюоптичного шляху 10 мм.

Розрахунок концентрації білка в досліджуваній пробі сечі здійснюють за формулою:

де С - концентрація білка в досліджуваній пробі сечі, г/л; Апр і Аст-екстинкція досліджуваної проби сечі та стандартного розчину альбуміну, г/л; 0,5 - концентрація стандартного розчину альбуміну, г/л.

фарбування розчину (кольорового комплексу) стабільне протягом однієї години;
прямо пропорційна залежність між концентрацією білка в досліджуваній пробі та поглинанням розчину залежить від типу фотометра;
при вмісті білка в сечі вище 3 г/л пробу розводять ізотонічним розчином хлориду натрію (9 г/л) і повторюють визначення. Ступінь розведення враховують щодо концентрації білка.